rhLIF与IL-24基因协同诱导HL-60细胞的凋亡

目的:构建能稳定表达白血病抑制因子(LIF)的转基因细胞,并研究所表达的LIF与IL-24基因在诱导HL-60细胞凋亡方面的协同作用。方法:用真核表达质粒pcDNA3-LIF转染ECV304细胞,G418筛选阳性细胞,收集阳性细胞和培养上清,RT-PCR检测LIFmRNA的表达。同时在已转化重组腺病毒质粒的大肠杆菌中抽提质粒pAdEasy-1-pTrack-CMV-IL-24,用PacI酶切使重组腺病毒质粒线性化,脂质体转染QBI-293A细胞,收获Ad-IL-24腺病毒子。将重组病毒子(Ad-IL-24)感染HL-60细胞,同时加入含LIF的培养上清,并设对照组,RT-PCR检测IL-24 mRNA表达,光镜下观察HL-60细胞形态的变化,激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫细胞化学分析凋亡因子的改变。结果:成功构建能稳定表达LIF蛋白的转基因细胞;获得高滴度的重组腺病毒Ad-IL-24,用它感染HL-60细胞后,能检测到IL-24 mRNA的表达。各种检测方法表明LIF、IL-24基因都能抑制HL-60细胞生长、诱导凋亡,且两者具有协同作用。结论:LIF、IL-24基因都能抑制HL-60细胞生长,诱导凋亡,两者具有协同作用。

造血干细胞及相关细胞因子

血液中的血细胞均来自造血干细胞,它独特的生物学特点为许多疾病的治疗开辟了新的途径,HSC的增殖、存活及定向分化受到多种因子的调控。如何在体外通过各种方法大量扩增造血干/祖细胞,又保持其体内造血重建能力显得尤为重要。

多重PCR-SSP方法在RHD基因检测中的应用

目的应用分子生物学诊断方法分析RhD阴性献血者的RHD基因。方法首先采用多重PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)方法扩增377名RhD阴性无偿献血者的RHD基因特异性内含子4和外显子7,对扩增结果为阴性的标本则继续采用PCR-SSP检测RHD基因启动子和外显子10。结果 337名RhD阴性无偿献血者中,24.92%(84/337)为RHD基因内含子4和外显子7阳性,余253例内含子4和外显子7阴性标本中的8.69%(22/253)为启动子和外显子10阳性;本组RhD阴性无偿献血者的RHD基因阳性率为31.45%(106/337)。结论多重PCR-SSP方法检测RHD基因简单易行,可用于对血清学RhD阴性者的RHD基因确认。

中国江苏地区汉族RhD阴性个体RHCE基因型多样性研究

本研究探究中国江苏地区血清学RhD阴性献血者中,含有RHD基因的献血者和不含RHD基因献血者中的RHCE基因型。采用聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法分析337例血清学RhD阴性无偿献血者的RHCE基因型;同时采用PCR-SSP扩增这些献血者RHD基因特异性位点。结果表明:337例血清学RhD阴性,其中RHD基因阳性献血者RHCE*C/C 20例,RHCE*C/c 62例,RHCE*c/c 24例,RHCE*C及RHCE*c基因频率分别为0.4811和0.5189;RHCE*E/E 0例,RHCE*E/e 25例,RHCE*e/e 81例,RHCE*E及RHCE*e基因频率分别为0.1179和0.8821。231例RHD基因阴性献血者中RHCE*C/C 3例,RHCE*C/c 34例,RHCE*c/c 194例,RHCE*C及RHCE*c基因频率分别为0.0866,0.9134;RHCE*E/E 0例;RHCE*E/e 15例;RHCE*e/e 216例;RHCE*E及RHCE*e基因频率分别为0.0325,0.9675。结论:在中国江苏地区RHD基因阴性人群中,RHCE基因主要以RHCE*ccee为主。中国江苏地区血清学RhD阴性的献血者中,RHCE基因型在含有RHD基因组和不含RHD基因组存在统计学差异。

血清学Rh(D)阴性个体分子机制的研究

目的探讨江苏地区无偿献血者中血清学Rh(D)阴性表型汉族人群的分子背景。方法 37份常规血清学试验检测出的Rh(D)阴性江苏汉族人,采用PCR-SSP检测RHCE基因和RH(D)基因;并对存在RH(D)基因的个体进行10个外显子及邻近内含子的测序。结果 37例血清学Rh(D)阴性献血者中,分子生物学方法确认26例无RH(D)基因。存在RH(D)基因的11例中,3例为RH(D)和RHCE基因发生互换,6例为RH D(K409k)(第9外显子1 227G>A),1例为弱D15型(第6外显子845G>A),1例为RH(D)*711delC(第5外显子711位碱基缺失)。结论一定比例的血清学阴性Rh(D)人群并非真正的Rh(D)阴性,即表达弱D抗原。提示对血清学Rh(D)阴性个体进行分子生物学分析,有利于安全输血。

CD34^+造血干/祖细胞在转hLIF基因腺病毒载体饲养层细胞中的扩增及其移植SCID小鼠的实验研究

目的:建立转hLIF基因腺病毒载体的饲养层细胞,观察对CD34+造血干/祖细胞的扩增作用,并研究移植辐射损伤模型SCID小鼠的效果。方法:建立转hLIF基因腺病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法鉴定目的基因;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果,建立辐射损伤模型SCID小鼠,将扩增后的CD34+造血干/祖细胞经CFDASE荧光标记后移植入SCID小鼠体内,通过RT-PCR和观察荧光标记细胞来检测小鼠内的人源细胞。结果:建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法证实有目的基因表达,免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞纯度可达(95.6±2.58)%,与饲养层细胞共培养后CD34+造血干/祖细胞可扩增13.2倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量仍较高,移植入SCID小鼠四周后,仍可见带有荧光标记的人源细胞,RT-PCR证明人源基因Alu的存在。结论:建立的转hLIF基因腺病毒载体饲养层细胞可以有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且有较高的移植效率和造血活性。

LIF基因修饰的ECV-304细胞对脐血造血细胞体外培养的影响

目的观察经LIF基因修饰的ECV-304细胞对脐血造血干/祖细胞(HSC/HPC)体外培养的影响。方法用脂质体转染法将pcDNA3.0-LIF真核表达质粒导入ECV-304人脐静脉内皮细胞,并通过G418筛选获得能稳定表达LIF的ECV-304转基因细胞。用LIF基因修饰的ECV-304细胞与脐血CD34+细胞共培养,检测培养前后CD54+细胞、CD34+CD54+细胞和CD34+CD62L+细胞数量的变化,观察转LIF基因的ECV-304细胞对脐血造血细胞的影响。结果成功获得经LIF基因修饰的ECV-304转基因细胞,该细胞能支持脐血CD34+细胞的扩增,且能维持细胞表面与归巢有关的黏附分子的表达,培养后CD34+CD54+和CD34+CD62L+细胞亚群数量显著增加。结论经LIF基因修饰的ECV-304细胞可改善脐血造血细胞体外培养的微环境,有助于抑制HSC/HPC的分化并保持其归巢能力。

PCR-SSP检测RhD阴性献血者的RHCE基因型

目的研究江苏省血清学RhD阴性献血者中,含有RHD基因的献血者和不含RHD基因献血者中的RHCE基因型。方法对江苏省血液中心和无锡市红十字中心血站无偿献血者中337例血清学RhD阴性献血者,DNA离心柱法提取血液中的基因组DNA,采用多重聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法扩增RHD基因特异性内含子4和外显子7;如为阴性,则继续检测是否含有RHD基因启动子和外显子10。并进一步检测这些献血者的RHCE基因型。结果337例血清学RhD阴性无偿献血者中有84例为RHD基因内含子4和外显子7阳性,其余253例中有22例为启动子和外显子10阳性;

LIF基因在COS-7细胞中的表达及活性研究

目的人白血病抑制因子(LIF)基囚在COS-7细胞中进行瞬时表达,检测表达产物对HL-60白血病细胞的作用。方法用脂质体转染法将pcDNA3．0-LIF真核表达质粒导入COS-7细胞,通过形态学观察、MTT、FCM法研究COS-7细胞表达产物对HL-60细胞的影响。结果人LIF基因可在COS-7细胞中进行有效表达,表达产物对HL-60白血病细胞具有抑制生长和诱导凋亡的作用。结论人LIF基囚在COS-7细胞中能有效表达,表达产物具有较强的抑制白血病细胞生长,诱导细胞凋亡的作用。

逆转录病毒载体介导的hLIF基因真核稳定表达体系的建立

目的构建逆转录病毒载体介导的人白血病抑制因子(human leukemia inhibitory factor,hLIF)基因真核稳定表达细胞株。方法采用DNA重组技术,构建并鉴定重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF;以脂质体转染法,将重组逆转录病毒载体与辅助质粒HIT456、HIT60共转染入包装细胞系293T包装逆转录病毒,感染人胚肾成纤维细胞系,经zeocin筛选获得真核稳定表达细胞株;采用RT-PCR法和ELISA法鉴定hLIF基因的转录和翻译,并检测表达上清中hLIF因子对人白血病细胞HL-60的生物学活性。结果PCR产物电泳后于609 bp处见特异性条带。双酶切出现两条带,其中位于609 bp处可见相应条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的hLIF基因的CDS序列完全一致。RT-PCR结果显示表达细胞中存在hLIF基因转录,ELISA结果测定表达上清中hLIF的浓度为110.134 pg/ml。结论携带hLIF基因的重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF构建成功,并且获得了稳定表达hLIF基因的人胚肾成纤维细胞株,这为此基因的临床应用和实验研究打下了基础。

人白细胞介素24研究进展

人类黑色素瘤分化相关基因-7/白介素-24(MDA-7/IL-24)是近年发现的具有细胞因子特性的抗肿瘤基因,能够通过膜受体或非受体介导的凋亡途径对多种肿瘤细胞产生杀伤作用,对正常细胞没有影响。此外,IL-24还具有抑制肿瘤新生血管形成、增强放疗敏感性和免疫调节等作用,与其他方法联合应用能明显提高抗肿瘤效应,其腺病毒制剂INGN241已经进入Ⅱ期临床试验并已显示出良好的治疗效果。IL-24有望成为将来肿瘤治疗的新武器。

IL-24基因修饰增强CIK细胞对HL-60细胞的细胞毒作用

目的:研究IL-24基因修饰的CIK细胞与同源树突状细胞共培养后对白血病细胞的杀伤作用及其机制。方法:从健康人外周血单个核细胞中常规诱导DC和CIK细胞,电穿孔法将IL-24基因导入CIK细胞中(获得细胞为CIK-IL24),RT-PCR和ELISA法检测CIK细胞中IL-24基因的表达,FCM和ELISA法检测转基因前后CIK表型及分泌细胞因子能力的变化,将CIK细胞和同源DC共培养,FCM法检测共培养的DC-CIK细胞对HL-60细胞细胞毒活性的变化。结果:通过电穿孔法成功将IL-24基因导入CIK细胞,与对照组相比,转IL-24基因后CIK细胞中CD3+、CD3+CD56+细胞的比例无明显改变,CD4+CD25+细胞比例显著下降。IL-24可上调CD3+CD56+细胞表面粘附分子CD54、CXCR4的表达,转染IL-24基因后CIK分泌TNF-α和IFN-γ的能力显著增强,与DC共同作用HL-60细胞时转染IL-24基因后的CIK细胞细胞毒活性明显增强。结论:通过IL-24基因修饰,明显增强了CIK细胞对HL-60细胞的杀伤能力,其机制与IL-24促进CIK分泌TNF-αI、FN-γ,上调CIK细胞表面粘附分子的表达,减少CD4+CD25+调节性T细胞比例等密切相关。

RGD修饰的腺病毒介导LIF和IL-24双基因共表达对MEG01白血病细胞的抑制作用

目的利用RGD修饰改造白血病抑制因子(LIF)和白细胞介素-24(IL-24)双基因共表达腺病毒载体,以提高感染效率,探讨其对人白血病MEG01细胞的抑制作用。方法同源重组法构建RGD修饰的表达LIF、IL-24的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。在QBI-293A细胞中扩增腺病毒,检测病毒滴度。流式细胞仪检测各组腺病毒载体对MEG01细胞的感染效率。应用Western blotting检测目的基因LIF、IL-24在MEG01细胞中的表达。CCK-8法检测各组腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24感染MEG01细胞后对细胞增殖的影响。PE-Anexin V/7-AAD双染后,经流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达。PI染色后,流式细胞仪检测目的基因表达对MEG01细胞周期的影响。实时定量PCR检测细胞周期调控基因p21和E2F1的表达。结果成功构建了RGD修饰的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。RGD修饰后的腺病毒能够显著增强对MEG01细胞的感染效率。CCK-8检测显示,与PBS组比较,携带单个目的基因的腺病毒载体Ad.RGD-LIF和Ad.RGD-IL24在第5 d对细胞生长的抑制率分别为29.2%和31.5%,均能够显著抑制MEG01细胞的生长;携带Ad.RGD-LIF-IL24双基因组的抑制率达42.5%,优于单基因组,差异均有统计学意义(P<0.05)。凋亡检测显示,与PBS组(4.5%)和空病毒组Ad.RGD(7.4%)比较,Ad.RGD-IL24(20.9%)、Ad.RGD-LIF(17.8%)均能够显著促进细胞凋亡,且Ad.RGD-LIF-IL24双基因组(29.7%)的促凋亡作用更强。Western blotting显示,LIF和IL-24能够提高促凋亡蛋白p53、Bax的表达,同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达。目的基因LIF、IL-24过表达会影响MEG01细胞周期的进程,使细胞阻滞在G2期。实时定量PCR显示,LIF和IL-24能够上调细胞周期调控基因p21的转录,抑制E2F1的表达。结论 LIF和IL-24过表达的腺病毒载体在体外通过调节p53、Bax、Bcl-xl的表达,影响白血病细胞MEG01的生长,诱导其凋亡,并通过调控p21、E2F1的水平影响细胞周期的进程。

Ad-hOSM转基因饲养层细胞对脐血CD34^+造血干/祖细胞增殖及归巢能力的影响

目的:建立转人抑瘤素M(hOSM)基因腺病毒载体的饲养层细胞,观察转基因细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞扩增的影响,比较扩增前、后造血干/祖细胞体外迁移能力的变化。方法:建立转hOSM基因腺病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法和ELISA法鉴定目的基因;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术(FCM)检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,FCM检测各组增殖效果;扩增后的造血干/祖细胞用跨膜迁移实验(Transwell实验)检测自发迁移率和SDF-1诱导迁移率以鉴定体外扩增的造血干/祖细胞的归巢能力。结果:建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法证实有目的基因表达,免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干/祖细胞纯度可达(96.8±2.28)%,与Ad-hOSM转基因饲养层细胞共培养7 d后CD34+造血干/祖细胞可扩增15.73倍,表面黏附分子CXCR4和CD54表达量仍较高,培养后的细胞用Tran-swell板做体外迁移实验,与转基因饲养层细胞共培养的干细胞,其诱导迁移率为(40.68±1.35)%,明显高于对照组,可以较好的保持其归巢能力。结论:转hOSM基因腺病毒载体的饲养层细胞可有效扩增脐血CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且体外扩增后仍保持较高的归巢能力。

转白血病抑制因子基因人胚肺成纤维细胞对脐血CD34^+细胞体外扩增的影响

背景:单份脐血的造血细胞数量有限,难以满足成人的需要,如何有效地扩增脐血造血干/祖细胞是目前研究的热点。目的:构建人白血病抑制因子基因修饰的人胚肺成纤维细胞,观察转基因细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞体外扩增的影响。方法:建立转人白血病抑制因子基因的饲养层细胞,用RT-PCR法和ELISA法鉴定目的基因的表达;采用免疫磁珠法分离脐血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果;扩增后的造血干/祖细胞用跨膜迁移实验检测自发迁移率和基质细胞衍生因子1诱导迁移试验以鉴定体外扩增的造血干/祖细胞的归巢能力。结果与结论:成功建立转基因饲养层细胞,RT-PCR法和ELISA法证实有目的基因表达,与人白血病抑制因子转基因饲养层细胞共培养7d后CD34+造血干/祖细胞可大量扩增,同时表面黏附分子的表达量仍较高。体外迁移实验显示与转基因饲养层细胞共培养的造血细胞的诱导迁移率明显高于对照组,可以较好地保持其归巢能力。因此转人白血病抑制因子基因的饲养层细胞可有效扩增脐血CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且体外扩增后仍保持较高的归巢能力。

无锡地区献血者D变异体的检定结果

目的准确地检定D变异体,并探讨其在安全输血中的意义。方法通过AS-PCR方法测定RHD1227A等位基因,检定Del血型;通过血清学方法检出D弱反应性标本,然后通过PCR方法鉴定部分D和弱D。结果 351份盐水抗-D阴性标本,检出Del32例,部分D 3例,弱D 4例。结论准确检定D变异体对制定安全有效的临床输血策略具有重要意义。

等位基因特异性PCR技术在DEL表型基因分型中的应用

目的:建立DEL表型的基因分型方法,用于快速鉴定DEL表型。方法:用RHBox基因分型方法鉴定标本的基因型,用血清学方法确定标本的DEL表型。根据RHD1227A等位基因序列设计等位基因特异性-聚合酶链反应(allele specific-polymerase chain reaction,AS-PCR),用于DEL表型基因分型,结果同血清学的方法作比较,探讨临床应用的可行性。结果:28例RHBox基因分型为RHD-/RHD-的标本,血清学方法、基因分型方法DEL表型鉴定结果均为阴性;在25例RHBox基因分型为RHD+/RHD-或RHD+/RHD+的标本中,用血清学方法检出的11例DEL表型标本,基因分型方法均扩增到867 bp的1227A等位基因条带;1例血清学方法阴性,而基因分型方法检测为阳性,后经测序分析证实RHD1227A为阳性,分析此例标本可能为血清学方法漏检。这说明在鉴定DEL表型的方法中基因分型方法比血清学有更高的灵敏度。结论:AS-PCR方法可用于临床筛选Rh阴性人群中的DEL表型。

生长抑制因子4基因表达对K562细胞生长的影响

目的研究生长抑制因子4(ING4)基因表达对 K562细胞增殖的影响。方法将经过定点突变技术人源化改造的 ING4(鼠→人)生长抑制因子4基因酶切并连接到 pAdTrack-CMV 转移质粒上,然后与腺病毒质粒 pAdEasy-1共转化 BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒 pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-hING4,将它转染 QBI-293A 细胞后收获重组腺病毒 Ad-hING4(以下简称为 Ad-ING4)。将 Ad-ING4感染 K562细胞,光学显微镜下观察病毒感染前后细胞形态的变化,免疫细胞化学分析凋亡因子的改变,激光扫描共聚焦显微镜观察 K562细胞的凋亡,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率。结果成功构建了人 ING4腺病毒质粒,获得高滴度的重组腺病毒 Ad-ING4,用它感染 K562细胞72 h后,FCM 法测定细胞凋亡率为19.7%,与空病毒对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),ING4基因能下调 K562细胞 bcl-2的表达并上调 bax 的表达,多种方法检测结果表明 ING4基因能抑制 K562细胞生长,诱导凋亡。结论重组腺病毒 Ad-ING4可以显著抑制 K562细胞的生长。