RNA干扰抑制RAD51基因表达对放射敏感性影响的实验研究

目的:构建针对DNA双链断裂修复基因RAD51的siRNA表达质粒,观察对肝癌细胞株HepG-2放射敏感性的影响。方法:采用基因重组技术,构建针对RAD51基因的干扰质粒pSilencer-1、pSilencer-2、pSilencer-3及对照质粒pSilencer-C,经脂质体转染HepG-2细胞,200μg／mL潮霉素筛选稳定表达的细胞,用Western blot测定RAD51蛋白表达量的改变,用细胞克隆形成实验测定细胞放射敏感性。结果:筛选出稳定转染各组质粒的细胞;转染pSilencer -1、pSilencer-2和pSilencer-3质粒细胞克隆的RAD51蛋白表达量分别为转染pSilencer-C细胞克隆的0．60±0．29、0．36±0．16和0．15±0．09,t值分别为4．101、6．561和8．714,P值分别为0．049、0．003和0．001。pSilencer-C组、pSilencer-2组和pSilencer-3组三组剂量存活曲线的D0值分别为1．55、1．46和1．44,Dq值分别为3．31、3．16和2．82,SF2分别为0．82、0．73和0．67 Gy;与pSilencer-C组相比,pSilencer-2组和pSilencer-3组在2 Gy剂量时的放射增敏比SERSF2分别为1．12和1．23。结论:RNAi抑制RAD51基因的表达,能提高HepG-2细胞的放射敏感性,提示RAD51基因可作为放射增敏治疗的一个潜在靶点。

同源重组与肿瘤发生

同源重组是真核细胞修复DNA双链断裂损伤的一种重要途径 ,同源重组相关基因的突变导致基因组不稳定 ,增加肿瘤的发生率。近年来对同源重组的分子机制、参与的基因及其功能有了较为全面的认识 ,发现同源重组修复在肿瘤发生中发挥着重要作用。

RNA损伤修复

传统的观念认为RNA损伤修复远不如DNA损伤修复重要 ,然而 ,随着RNA甲基化损伤修复机制及RNA修复酶的发现 ,这一观点受到了巨大的挑战。RNA损伤可以诱导细胞周期阻滞和凋亡 ,RNA修复可能是一种细胞防御机制 ,在细胞损伤应激反应中发挥重要作用 。

ABO基因启动子CpG岛甲基化与白血病的相关性

近年来研究发现ABO血型与许多疾病的发生发展相关,某些肿瘤导致A、B血型物质减少的现象已日益引起关注。本研究探讨ABO基因启动子CpG岛甲基化与白血病的相关性。采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测了不同血型的健康人群和各种血液病患者外周血红细胞表面ABH抗原的相对含量,用PCR和MSP-PCR分别检测血液病患者和健康人ABO基因启动子DNA序列和CpG岛甲基化,以及ABO基因启动子-102位点的甲基化。结果发现,白血病患者均出现不同程度的A、B抗原减少;通过对比检测健康人和患者的ABO基因启动子序列,未发现有序列的不同,说明启动子序列高度保守;利用重亚硫酸盐对DNA样本进行修饰后,通过对健康人和患者的ABO基因启动子序列进行扩增和测序,发现健康人和再生障碍性贫血患者在ABO基因启动子的CpG岛区没有甲基化的位点,而急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)和部分骨髓增生异常综合征(MDS)患者在位置为-102、-101、-100、-99和-97位置的C碱基均有甲基化的现象。结论:甲基化是造成白血病患者AB抗原下降的原因;-102、-101、-100、-99和-97这几个甲基化位点有可能是白血病的特异性表现;针对-102位点检测结果提示-102位点是否甲基化有可能作为白血病鉴别诊断中一个有意义的分子标识物。

自制酸奶乳脂中c9,t11-共轭亚油酸对小鼠免疫调节作用的影响

应用乳酸菌发酵法,添加适当底物和营养物质,实验室自制含共轭亚油酸(CLA)的酸奶,经过提取乳脂、气相色谱检测并对CLA定量后,确定给予小鼠受试物剂量组,进行共轭亚油酸酸奶的免疫调节功能实验。结果表明:灌胃给予小鼠含0.05g/(kgbw·d)c9,t11-CLA的乳脂,30d后可增强小鼠的免疫调节功能,说明酸奶中的c9,t11-CLA能够显著增加小鼠免疫调节能力。

联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶实现红细胞AB→O血型转变

目的研究酶解去除AB型红细胞表面的A和B抗原、实现AB→O血型转变的方法,以获得通用型红细胞。方法联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶酶解AB型红细胞,用单克隆抗-A、抗-A1和抗-B抗体检测酶解效果,用稀有血型抗体检测酶解前后红细胞表面的稀有血型,用流式细胞术检测酶解前后红细胞表面A、B、H抗原,原子力显微镜观察酶解前后红细胞形态,主侧配血试验检测酶解红细胞是否符合临床输血要求。结果A1B和A2B亚型红细胞的A、A1和B抗原均能够完全被酶解去除,酶解前后红细胞的稀有血型抗原不变;流式细胞术显示,酶解后AB型红细胞表面的A和B抗原消失,而H抗原明显增加,和O型红细胞相当;酶解不影响红细胞的形态;主侧配血试验证明酶解改造后的AB型红细胞可以安全输给O、A、B、AB等各型受血者。结论联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶成功实现了AB→O血型转变,获得酶解通用型红细胞。

重组α-N-乙酰半乳糖胺酶工程菌菌种稳定性研究

目的探讨重组α-N-乙酰半乳糖胺酶工程菌菌种的遗传稳定性。方法在有选择压力(AMP+)条件下,将重组a-N-乙酰半乳糖胺酶工程菌菌株在LB固体培养基上采用划线法连续传60代,每隔20代取样保存菌种,最后同时进行菌体形态、生长速度和抗生素抗性、质粒稳定性、限制酶切图谱、测序、表达量和酶活力及Westernblotting检测。结果第0、20、40、60代菌的菌体形态、生长速度和抗生素抗性等与原代菌株无明显差异;LB固体培养基上传60代后质粒稳定性接近100%;DNA测序未见α-N-乙酰半乳糖胺酶基因变异;SDS-PAGE图谱显示,α-NAGA表达水平无明显差别。Western blotting检测显示重组α-NAGA能与抗His的单抗特异结合。结论α-N-乙酰半乳糖胺酶重组质粒pET22b-α-NAGA在工程菌株中具有良好的遗传稳定性。

RNA干扰抑制胰腺癌细胞DNA-PKcs基因表达对放射敏感性的影响

目的探讨稳定表达的siRNA抑制DNA-PKcs基因表达对胰腺癌细胞BxPC-3放射敏感性的影响。方法以人胰腺癌细胞BxPC-3为研究对象,将预先设计的siRNA与质粒连接。构建质粒与阴性对照质粒分别转化大肠杆菌,经克隆、扩增、纯化后转染BxPC-3细胞,潮霉素筛选,以半定量Westernblot检测靶蛋白表达变化,用细胞克隆计数实验检测放射敏感性变化。结果成功构建以DNA-PKcs基因mRNA为靶序列的pSilencer2.1质粒,经潮霉素筛选出稳定的整合目的质粒的BxPC-3细胞,DNA-PKcs蛋白被抑制最大达到83%,实验组D0、Dq及SF2(1.284±0.017、4.006±0.023和0.567±0.045)均明显低于阴性对照组(1.458±0.026、4.840±0.019和0.833±0.076)(P<0.001)。SER为1.47。结论针对DNA-PKcs基因的siRNA表达载体稳定转染人胰腺癌细胞BxPC-3,能够引发DNA-PKcs表达抑制,进而产生放射增敏作用。

^(60)Coγ射线照射对脆性组氨酸三联体基因表达的影响

目的 :研究脆性组氨酸三联体 (fragile histidine triad,FHIT)基因在电离辐射损伤和辐射致癌早期过程中的作用。方法 :将 4 0只 BAL B/ c小鼠随机分成对照组和 1.8、3.6、5 .4、7.2 Gy照射组共 5组 ,每组 8只动物。照射后 1个月用乙醚麻醉小鼠 ,心脏抽血 ,再解剖取胸腺及骨髓细胞 ,抽提其总 RNA。采用巢式 RT- PCR方法及 PCR产物直接测序法检测 FHIT基因的表达情况。 结果 :对照组血液、胸腺及骨髓均未出现异常 FHIT转录本的表达 ,不同剂量照射组中血液、胸腺及骨髓均有部分样品出现相对分子质量较小的异常 FHIT转录本的表达。测序证实异常转录本缺失 2个或 2个以上的 FHIT外显子。结论 :电离辐射可引起 FHIT基因的缺失 。

提高酸乳中c9,t11-共轭亚油酸含量的研究

本研究利用乳酸菌发酵法,添加合适的底物,在形成酸乳的同时提高乳中c9,t11-共轭亚油酸,c9,t11-CLA的含量,筛选菌株的最佳配比条件,研究影响CLA含量的因素,发现奶中影响酶促反应和菌株生长的营养成分均可以影响乳酸菌发酵中CLA的产生。应用气相色谱检测出乳酸菌培养液中CLA的其它异构体。

新型高比活力α-N-乙酰半乳糖胺酶应用于人红细胞A→O血型改造

α-N-乙酰半乳糖胺酶(α-N-acetylgalactosaminidase,αNAGA)是进行人红细胞(reblood cell,RBC)A→O血型改造的工具酶.采用PCR法从国内临床标本的脑膜脓毒性金黄杆菌中克隆出新型αNAGA基因,应用基因工程和蛋白质纯化技术获得足量高纯度的重组酶.重组酶分子量为49.6kD,专一性强,比活力高,在25℃及pH6.8条件下,1h内完全酶解1UA1型浓缩RBC(约100mL/U)需1.5mg酶,而1h内完全酶解1UA2型浓缩RBC仅需0.4mg酶.酶解后的A型RBC与抗A单克隆抗体、人源O型血清反应均不凝集,与A,B,O,AB等各型血清的主侧配血实验成功,主要稀有血型不变.流式细胞仪检测结果表明,酶解后A抗原和A1抗原消失,H抗原增加,证明A→O血型改造成功获得的酶解通用型RBC可以安全输给A,B,O,AB等各型受血者,不会因ABO血型不合发生输血反应.脑膜脓毒性金黄杆菌来源的αNAGA是十分理想的A→O血型改造的工具酶,具有良好的应用前景,对于提高输血安全性、消除血液偏型、节约输血成本、增强应急输血保障能力具有重要意义.

siRNA抑制STAT3基因对HepG2细胞辐射敏感性的影响

目的 研究瞬时转染的siRNA抑制STAT3基因表达对人肝癌HepG2细胞辐射敏感性的影响。方法 以人肝癌HepG2细胞作为研究对象，脂质体包裹化学合成的siRNA进行转染。采用实时RT-PCR和Westernblotting法分别从mRNA水平和蛋白水平检测STAT3基因的表达及编码蛋白磷酸化活化的改变，用CCK-8法和Hoechst33258DNA染色法检测辐射敏感性的变化。结果STAT3特异性的siRNA转染后HepG2细胞中STAT3基因mRNA拷贝数、STAT3蛋白表达和磷酸化水平均明显降低。mRNA水平的抑制效率可达70％。siRNA转染联合60Coγ射线照射后HepG2细胞增殖活力显著低于对照组（P〈0．05）。结论 针对人STAT3基因的siRNA能够抑制HepG2细胞STAT3基因的表达，降低STAT3蛋白活化水平，进而产生辐射增敏作用。

国家科技计划体系现状分析

国家科技计划体系是随着国民经济和社会发展而不断调整完善的，“十一五”国家科技计划体系在“十五”国家科技计划体系的基础上形成，本文重点介绍了“十一五”国家科技计划体系的总体布局，并分析其特点，提出了一些思考和建议。