Hyper-IL-6融合基因的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建融合基因Hyper-IL-6并在真核细胞中进行表达。方法:采用基因拼接(GeneSOEing)法将人类可溶性白细胞介素6受体和白细胞介素6的编码基因用一富含甘氨酸序列的接头经PCR扩增融合,并定向克隆至pIRES2-EGFP,构建与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒,转染哺乳动物细胞,通过绿色荧光蛋白、RT-PCR和免疫组化检测Hyper-IL-6蛋白的表达。结果:PCR扩增出1224bp的Hyper-IL-6编码序列并成功构建重组质粒pIRES-HIL-6,重组质粒转染真核细胞后经检测证实Hyper-IL-6能在真核细胞中表达。结论:人类Hyper-IL-6重组表达质粒的成功构建与真核表达为以后对其进行活性分析和生物学功能的研究提供了基础。

稳定表达融合基因Hyper-IL-6的肝癌细胞克隆株的建立

Hyper-IL-6是Fischer等依据白细胞介素6受体（interleukin 6 receptor，IL-6R）的结构信息设计的一种“设计细胞因子（designercytokines）”，即将人类IL-6基因与截短形式的可溶性细胞介素6受体（soluble interleukin 6 receptor，sIL-6R）基因通过基因操作共价连接，并在真核细胞进行表达得到的一种具有超高效IL-6活性的融合蛋白。

环介导恒温扩增技术在百日咳鲍特菌检测中应用研究进展

核酸扩增技术是病原微生物检测的重要武器,其中聚合酶链反应（PCR）技术已经在临床检验中广泛应用。与PCR相比,环介导恒温扩增（LAMP）技术具有操作简便,快速灵敏,对仪器和样本质量要求低等优点,尤其适合病原微生物的即时检验。

百日咳鲍特菌MALDI-TOF MS谱库的扩展及鉴定效果评价

目的对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术鉴定百日咳鲍特菌谱库进行扩展。方法采用Microflex LT软件,用经全基因组测序确认的9株百日咳鲍特菌和1株副百日咳鲍特菌构建蛋白质指纹谱库,对布鲁克数据库进行扩展。对标准菌株ATCC 29213、ATCC 25922、ATCC 700603、ATCC 27853进行MALDI-TOF MS鉴定,评价扩展库的准确性。选取6株百日咳鲍特菌,每个菌株取3个菌落分别用MALDI-TOF MS鉴定,评价试验的精密度。采用36株临床分离株验证扩展谱库对百日咳鲍特菌的识别能力,并进行扩展库前后鉴定结果比较。结果成功构建9株百日咳鲍特菌和1株副百日咳鲍特菌参考谱库,并扩展现有布鲁克数据库Taxonomy(5989)数据库为Taxonomy(5989+)。扩展库准确鉴定4株标准菌株ATCC 29213、ATCC 25922、ATCC 700603、ATCC 27853,对鲍特菌鉴定无干扰;6株百日咳鲍特菌的重复鉴定符合率为100%,精密度良好。用于外部验证的36株菌经扩展后数据库鉴定,种水平鉴定率达86.1%。结论百日咳鲍特菌质谱库的扩展提升了地区性分离菌株鉴定能力。

实时荧光环介导恒温扩增技术检测布鲁菌方法的建立与评价

目的建立布鲁菌的实时荧光环介导恒温扩增(RealAmp)快速检测方法。方法针对布鲁菌属保守基因OMP 25,设计4套引物。通过引物筛选建立RealAmp检测布鲁菌的方法,并对此方法的灵敏度、特异性进行评价。结果该方法对非布鲁菌属标准菌株DNA扩增结果呈阴性,表明实验具有良好的特异性。RealAmp法检测布鲁菌DNA在30 min内即可完成,该方法检测灵敏度可达到1.2×10^-5 ng/μL。结论该研究建立的RealAmp测定方法简便、快速、灵敏,并且不依赖任何特殊设备,有望成为快速检测布鲁菌的新方法。

环介导恒温扩增技术研究进展

环介导恒温扩增技术(LAMP)是2000年由日本学者开发的一种新型核酸体外扩增技术。LAMP不仅广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原微生物检测,而且可以进行单核苷酸多态性分析。LAMP具有灵敏度高、特异性好、可定量分析、反应时间短、操作简单等优点,特别适合在基层实验室推广应用。随着LAMP技术的不断进展,其在标本前处理、引物设计、产物的特异性可视化检测方面也日臻完善。

Hyper-IL-6基因诱导的体内抗肝癌免疫功能

目的:建立稳定表达Hyper-IL-6基因的小鼠肝癌细胞株,探讨Hyper-IL-6用于诱导抗肝癌主动免疫治疗的可行性。方法:用脂质体法将Hyper-IL-6基因转染小鼠肝癌细胞系MM45T.Li,通过G418筛选获得抗性细胞株,命名为MM45T-HIL-6,RT-PCR和ELISA法检测目的基因的表达。同时筛选空载体pEGFP-C1转染的阳性克隆命名为MM45T-mock作为对照。将BALB/c小鼠随机分为3组,于各组小鼠右侧腋部皮下分别接种细胞MM45T.Li、MM45T-mock和MM45T-HIL-6 5×105个/只,体内实验观察MM45T.Li、MM45T-mock及MM45T-HIL-6的成瘤性,流式细胞仪检测荷瘤小鼠外周血中CD4+,CD8+T淋巴细胞亚群水平。结果:RT-PCR和ELISA检测结果表明,筛选到的小鼠肝癌细胞株MM45T-HIL-6中存在Hyper-IL-6的表达,而MM45T.Li和MM45T-mock不表达。体内成瘤实验结果显示,与MM45T.Li、MM45T-mock相比,MM45T-HIL-6的成瘤性下降;流式细胞分析结果显示,与接种MM45T.Li和MM45T-mock的小鼠相比,接种MM45T-HIL-6稳定表达HYPER-IL-6基因的小鼠肝癌细胞株的小鼠外周血中CD4+,CD8+T淋巴细胞水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:转染Hyper-IL-6基因的小鼠肝癌细胞株能够诱导小鼠抗肝癌主动免疫反应。

晚期肝病患者腹水培养与药敏结果分析

目的了解晚期肝病患者腹水中病原菌的分布及耐药性。方法利用法国梅里埃全自动体液培养系统和细菌鉴定系统,进行腹水培养、细菌鉴定与药物敏感试验。结果876份腹水培养标本中,检出细菌65株,阳性率7.4%,其中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌4种主要致病菌,占菌株总检出率64.6%。药敏结果显示绝大部分检出的葡萄球菌对青霉素类药物耐药,大部分的杆菌对氨苄西林、环丙沙星、复方新诺明呈不同程度的耐药。结论晚期肝病患者腹水培养病原菌以肠杆菌科细菌为主,药物敏感试验结果提示,这些病原菌耐药性强且广谱耐药,临床应加强腹水标本的细菌学检查,根据药敏试验结果,科学、合理使用抗生素,防止或延缓病原菌耐药性的产生。

手足口病患儿密切接触家属分泌物肠道病毒检测分析

目的了解手足口病(HFMD)患儿密切接触家属呼吸道、消化道分泌物肠道病毒检出情况。方法随机选取HFMD患儿密切接触家属50例,分别于患儿入院(急性期)及出院时(恢复期)采集咽拭子、粪便标本共200份,应用荧光定量RT-PCR方法进行肠道病毒(EV)核酸检测,包括EV、EV71、柯萨奇A组16型(CoxA16)。结果 EV阳性患儿密切接触家属总EV阳性率78%,其中97.3%为隐性感染者。HFMD患儿密切接触家属EV阳性检出率粪便明显高于咽拭子(P<0.05),且在患儿疾病恢复期阳性率高于急性期(P<0.05),尤其是粪便标本(P<0.05)。结论手足口患儿病密切接触家属EV隐性感染率高,应加入防控重点范围。

人工肝支持系统治疗慢性重型肝炎临床研究

目的 探讨人工肝支持系统 (ALSS)治疗慢性重型肝炎的疗效及可能机制。方法 对 85例慢性重型肝炎患者随机分为治疗组和对照组 ,对照组 4 3例患者只给予综合治疗 ,治疗组 4 2例患者在综合疗法基础上给予ALSS治疗 ,并分别检测治疗前后肝功能、凝血酶原时间 (PT)、肿瘤坏死因子 -α(TNF -α)、内毒素及一氧化氮(NO)水平。结果 慢性重型肝炎患者在ALSS治疗后 ,肝功能明显改善 ,PT、TNF -α、内毒素及NO水平明显下降 (P <0 .0 5～ 0 .0 0 1) ,血清Cl-水平也明显降低 (P <0 .0 0 1)。ALSS治愈好转率为 5 0 .0 % ( 2 1/ 4 2 ) ,而对照组治愈好转率为 2 0 .9% ( 9/ 4 3) ,两组疗效比较差异有显著意义 (P <0 .0 1)。ALSS不良反应发生率为 2 8.6 % ( 12 / 4 2 )。结论 ALSS治疗慢性重型肝炎能显著改善患者肝功能 ,并降低TNF -α、内毒素及NO等病理成分 ,能明显提高其治愈好转率 ,其中早、中期患者疗效明显好于晚期患者。

慢性丙型肝炎患者Ⅰ型干扰素受体启动子基因多态性与抗病毒疗效的关系

目的研究慢性丙型肝炎(CHC)患者Ⅰ型干扰素受体之一IFNAR1启动子基因的单核苷酸多态性与干扰素(IFN)α抗HCV疗效的关系。方法应用聚乙二醇干扰素α联合利巴韦林抗HCV治疗,根据抗病毒疗效将73例患者分为应答组与无应答组,并对其IFNAR1启动子基因进行扩增及测序。结果 73例患者中应答组47例,无应答组26例,在-568、-408、-77、-3位点发现基因多态性,共10种基因单体型,其中单体型-568C/-408C/-77(GT)5/-3C和-568C/-408T/-77(GT)5/-3T出现频率最高。非-568C/-408C/-77(GT)5/-3C者的抗病毒应答率77.1%高于-568C/-408C/-77(GT)5/-3C者52.6%,(χ2=4.773,P=0.029),-568C/-408T/-77(GT)5/-3T者的抗病毒应答率90.9%高于非-568C/-408T/-77(GT)5/-3T者59.7%,(χ2=3.92,P=0.048)。结论 CHC患者IFNAR1启动子基因多态性可能影响IFNα抗HCV治疗应答。

妊娠梅毒患者母婴传播的检测及干预治疗

目的探讨妊娠梅毒检出率及干预治疗对阻断母婴传播的效果。方法对孕妇及新生儿进行快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)及梅毒密螺旋体血凝试验(TPPA)确诊检查,对妊娠梅毒患者及其分娩的新生儿进行干预治疗并随访观察。结果在5194例孕妇中,RPR与TPPA均阳性117例,妊娠梅毒检出率为2.25%;在5 078例新生儿中,新生儿梅毒检出率为0.91%;孕妇治疗干预与新生儿脐带血梅毒快速血浆反应素(RPR)滴度的关系密切;新生儿脐带血RPR滴度随孕母RPR滴度升高而升高。结论早期诊断妊娠梅毒是阻断、改善妊娠梅毒结局和降低先天梅毒发生率的关键,应加强孕前及孕期的梅毒检测及综合干预治疗,有效阻断母婴垂直传播。

Smad4-siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的构建Smad4特异的RNA干扰质粒载体,为探讨抑制Smad4表达在肝纤维化治疗中的意义奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的Smad4基因核苷酸序列,选择设计能转录小发夹结构RNA(Small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与psilencer3.1-H1-hygro质粒载体连接,构建真核表达载体,使用限制性内切酶鉴定及测序鉴定是否为阳性克隆。结果成功构建psilencer3.1-Smad4载体,拟进一步采用RNAi技术观察其对Smad4基因表达的抑制情况,从而研究其在肝纤维化治疗中的作用。结论Smad4-siRNA真核表达载体被成功构建。

Hyper-IL-6重组腺病毒治疗大鼠急性肝衰竭

目的探讨重组腺病毒介导的超级白细胞介素6(Hyper-IL-6)对大鼠急性肝衰竭的治疗作用及机制。方法80只急性肝衰竭模型大鼠随机分为:未感染组、Ad0组、AdIL-6组、AdHIL-6组,分别予腹腔注射生理盐水、Ad0、AdIL-6、AdHIL-6,后进行肝功能指标、肝脏病理学及肝细胞原位凋亡检测,并观察增殖细胞核抗原(PCNA)、caspase-3在肝组织中的表达情况及大鼠14d存活率。结果AdHIL-6组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TB)含量及凋亡指数明显降低,而肝组织PCNA表达明显增高(P<0.01),肝组织病变减轻,caspase-3表达阳性,14d存活率较高。结论Hyper-IL-6对急性肝衰竭大鼠有明显的促肝细胞增殖及抗肝细胞凋亡效应,能有效改善肝功能及肝组织学状况,提高肝衰竭大鼠存活率。

Hyper-IL-6重组腺病毒的制备

目的探讨大量制备高滴度重组腺病毒的方法。方法以Pac-I酶切Hyper-IL-6重组腺病毒(AdHIL-6)质粒,乙醇沉淀回收DNA,将线性化的AdHIL-6质粒经脂质体转染293细胞进行病毒的包装扩增,以氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒,根据GFP(绿色荧光蛋白)计数法和有限稀释法原理测定病毒滴度及感染293细胞、L02细胞的MOI(Multiplicity of infection,感染复数),并以免疫细胞化学检测感染L02细胞后目的蛋白Hyper-IL-6的表达。结果收集的病毒液经PCR扩增出目的条带,测得病毒滴度为1.6×109pfu/mL,AdHIL-6感染293细胞、L02细胞的MOI分别是7和54,感染L02细胞后Hyper-IL-6强阳性表达。结论成功地完成了Hyper-IL-6重组腺病毒的制备,为后续的腺病毒载体介导的基因治疗奠定了基础。

手足口病继发细菌感染患儿病原菌分析及血炎性指标水平

目的:探讨手足口病患儿继发细菌感染的病原菌分布及炎性相关指标水平。方法:收集住院治疗的手足口病患儿625例,根据有无继发感染分为无感染组574例和继发感染组51例。观察继发感染组病原菌分布及耐药情况,比较两组患儿相关炎性指标水平。结果:手足口病继发感染患儿51例,共培养分离病原菌55株,革兰阴性菌27株(49.1%),革兰阳性菌26株(47.3%),真菌2株(3.6%)。主要病原菌为金黄色葡萄球菌,大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。革兰阳性菌对克林霉素及红霉素耐药性高,对万古霉素保持敏感;肠杆菌科细菌对头孢唑林和头孢呋辛中度耐药,对碳青霉烯类药物保持敏感。手足口病继发细菌感染患儿外周血白细胞(WBC)、中性粒细胞(NEUT)、血清C-反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)水平均高于无感染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:手足口病继发细菌感染病原菌以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主,对万古霉素和碳青霉烯类药物保持敏感。继发细菌感染患儿血清WBC、NEUT、CRP和PCT水平明显升高。

肝炎肝硬化患者隐球酵母菌属感染临床荟萃分析

目的分析隐球酵母菌属感染在肝炎肝硬化人群中的发病情况,增强医务人员对该病的了解,以减少误诊。方法检索1989年1月-2012年12月中国生物医学文献光盘数据库、万方数据库、中文科技期刊全文数据库中发表的肝炎肝硬化合并隐球酵母菌属感染病例报道文献,由两名研究者独立进行数据提取与统计分析。结果共33篇文献中的111例患者纳入研究,男性多于女性,平均年龄39.3岁;111例患者中表现为隐球酵母菌性脑膜炎的有109例,占99.1%;文献统计结果显示,临床表现93.5%的患者发热、85.1%的患者头痛、51.1%的患者有脑膜刺激征、34.0%的患者有意识异常、87.5%患者存在脑脊液压力升高、78.9%的患者存在血糖降低,其中有1例患者甚至出现顽固性低血糖。结论肝炎肝硬化合并隐球酵母菌属感染以青壮年男性多见,主要表现为隐球酵母菌性脑膜炎,临床表现以发热、头痛、脑膜刺激征、意识异常、视听神经损伤为主。

Hyper－白细胞介素－6与肝脏疾病

利用基因工程技术，将具有相互作用的两种细胞因子重组为一种独特的融合细胞因子，这种分子往往可发挥超越单因子的生物学活性和（或）具有其它特殊生物学功能。Hyper-IL-6是Fischer等依据已知的关于膜结合和可溶性白细胞介素6受体（SIL-6R）的结构信息设计的一种“设计细胞因子”（designer cytokines），即将人类白细胞介素6（IL-6）基因与截短形式的SIL-6R基因通过基因操作共价连接，并在真核细胞进行表达得到的一种具有超高效活性的融合蛋白，近年研究发现其在肝脏疾病中发挥重要作用。