稳定表达人ACE2的Huh-7细胞系的建立及应用

为了构建稳定表达人血管紧张素转换酶2(human angiotensin converting enzyme 2,hACE2)的Huh-7细胞系,本研究构建了不带荧光的pWPXL-neo-hACE2慢病毒载体,并利用psPAX2和pMD2.G-VSVG共同转染HEK293T细胞获得慢病毒;将包装好的慢病毒感染Huh-7细胞后,利用潮霉素B筛选获得可表达hACE2的Huh-7细胞;通过间接免疫荧光法和蛋白质印迹法检测Huh-7细胞中hACE2蛋白的表达;采用流式细胞术分析Huh-7-hACE2细胞与严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARSCoV-2)刺突(spike,S)蛋白受体结合结构域(receptor-binding domain,RBD)的结合情况,并用SARS-CoV-2假病毒进一步测定Huh-7-hACE2细胞对SARS-CoV-2的易感性,最后利用鉴定过的Huh-7-hACE2细胞测定SARS-CoV-2中和抗体REGN10987对假病毒的中和效价。结果显示,hACE2蛋白在Huh-7细胞中成功表达,且表达的hACE2蛋白能与SARS-CoV-2 S蛋白RBD结合;相较于Huh-7细胞,Huh-7-hACE2细胞对假病毒的易感性显著提高,且假病毒中和效价测定结果与文献报道的真病毒中和效价相似。总之,本研究成功构建了稳定表达hACE2的Huh-7细胞系,并且其能应用于新型冠状病毒感染(corona virus disease 2019,COVID-19)治疗性单抗的活性评价,是研究SARS-CoV-2的致病机制、开发抗病毒药物及疫苗的有利工具。

伪狂犬病毒的gE蛋白胞外区真核表达以及单克隆抗体制备

旨在构建gE基因胞外区真核表达载体,在HEK293F细胞中表达并纯化得到稳定的可溶性蛋白,并通过杂交瘤筛选获得表达gE蛋白的特异性单克隆抗体。生物信息学方法分析gE基因序列,构建gE胞外区真核表达载体pcDNA3.4-gE-6×His和pcDNA3.4-gE-m Fc,通过瞬时转染的方法在HEK293F细胞中进行表达并进一步纯化。通过Western blot和SDS-PAGE鉴定和比较gE-6×His和gE-mFc融合蛋白表达情况。利用伪狂犬灭活全病毒免疫小鼠,电融合获得杂交瘤融合细胞,通过gE-mFc蛋白和IFA筛选出稳定且特异性结合gE蛋白的阳性杂交瘤细胞株。结果表明,成功构建pcDNA3.4-gE-6×His和pcDNA3.4-gE-mFc表达载体,表达纯化得到gE-6×His和gE-mFc可溶性蛋白。比较发现gE-6×His蛋白表达量低,稳定性差。而gE-mFc蛋白表达量高,稳定性好,一次性纯化后纯度可达85%。进一步利用gE-mFc筛选获得9株稳定性和特异性高的阳性杂交瘤细胞株。首次利用哺乳动物细胞表达系统表达并获得稳定的可溶性gE蛋白,并利用其筛选获得g E特异性单克隆杂交瘤细胞株。

高纯度猪血清抗体Fab酶切片段的制备及活性鉴定

为了从猪血清中分离纯化IgG并制备其Fab片段,试验分别利用Protein G亲和层析法和辛酸-硫酸铵沉淀法(CA-AS法)纯化猪血清中IgG,再通过木瓜蛋白酶水解猪IgG得到Fab片段,并通过Protein A层析柱分离猪Fab和Fc片段,进一步利用凝胶层析纯化猪Fab。通过SEC-HPLC鉴定获得的猪Fab片段的纯度,并通过ELISA和Western-blot鉴定其活性。结果表明:成功从猪血清中纯化得到猪IgG,Protein G亲和层析法较CA-AS法获得的猪IgG纯度更高,纯度>95%,可用于后续猪Fab片段制备试验。木瓜蛋白酶与抗体质量比为1∶10时,水解15 h将猪IgG完全水解。进一步利用Protein A和凝胶层析法纯化猪Fab片段,SEC-HPLC鉴定获得猪Fab片段纯度>99%,ELISA和Western-blot鉴定其活性良好。说明试验成功从猪血清中分离猪IgG,并制备其Fab片段。

CD3E蛋白真核表达及全人源CD3单克隆抗体的制备

目的:高效真核表达和纯化获得CD3E蛋白,制备全人源CD3抗体。方法:构建CD3E链胞外区真核表达质粒,利用293F悬浮细胞表达系统表达并纯化获得高纯度蛋白。选取人源化抗体转基因小鼠CAMouse-HG76进行免疫,通过细胞融合的方法获得杂交瘤细胞,再利用ELISA法和流式细胞分析法筛选CD3特异性单克隆抗体。结果:成功构建重组表达载体pcDNA3.4-CD3E-mFc,真核细胞表达并纯化获得纯度为85%的融合蛋白。免疫小鼠后效价高达1∶102400。杂交瘤细胞筛选获得3株CD3特异性单克隆抗体。结论:本研究成功获得了CD3E融合蛋白和CD3单克隆抗体,为后续建立ELISA检测方法、全人源治疗性抗体药物及相关研究提供基础。

动物用口服抗体的研究进展

抗体是机体分泌的用来鉴别与中和外来病原微生物如细菌、病毒等的Y形蛋白质,具有保护机体健康的功能。口服抗体进入肠道内能够给予肠道被动免疫,使肠道免受病原微生物的感染。近些年来,越来越多的研究发现一些特异性抗体可免受胃环境的影响,立即在动物肠道内发挥保护作用。本文介绍了口服抗体的发展过程、作用机制、制备途径、稳定特性,并根据实际应用情况综述了天然抗体、基因工程抗体通过口服摄入的方式对动物肠道感染的保护作用。

稳定高表达人GPC3的SK-Hep-1细胞系的构建

目的获得稳定高表达人GPC3的SK-Hep-1细胞系。方法构建人GPC3真核表达载体pc DNA3.1-GPC3,通过电穿孔的方法转染至SK-Hep-1细胞,利用G418进行细胞筛选,获得稳定高表达GPC3的细胞系。再利用Western blot和流式细胞术进行鉴定,分析稳定转染细胞表面GPC3蛋白的表达情况。结果成功构建的真核表达质粒pc DNA3.1-GPC3,检测发现SK-Hep-1细胞G418最佳筛选浓度为700μg/m L,利用该浓度G418筛选转染SK-Hep-1细胞,获得了细胞表面能够稳定高表达人GPC3蛋白的SK-Hep-1细胞系。结论建立高表达人GPC3蛋白的SK-Hep-1稳定细胞系,为研究靶向GPC3肝癌抗体提供了物质基础。

细胞外囊泡传递CRISPR/Cas9系统的研究进展

CRISPR/Cas9系统能高效便捷的进行基因编辑,在多个领域深受青睐并广泛使用,其传递方法引起国内外大量研究学者的关注。细胞外囊泡(EVs)作为天然的纳米级载体,来源广泛,是一种极具吸引力的CRISPR/Cas9系统传递载体。与常规病毒载体或非病毒载体相比,EVs在安全性、容量、穿透力、靶向性和改造潜力等方面都具有明显优势,有望成为传递CRISPR/Cas9系统的最佳载体。总结了CRISPR/Cas9系统常见的传递策略和加载方式,将EVs与其他载体进行比较,并对EVs传递CRISPR/Cas9系统的优势及国内外研究进展、应用等进行综述,以期为基因编辑递送领域的发展提供帮助。

新型冠状病毒假病毒制备方法的优化及应用

该文旨在建立一种稳定高效的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒构建方法,并将所制备的假病毒用于评估抗体中和水平。通过比较不同穿梭质粒、质粒配比以及转染试剂对假病毒滴度的影响,优化制备高滴度假病毒的条件;通过制备不同的SARS-CoV-2突变株假病毒,测试该方法的稳定性;利用所制备的假病毒对SARS-CoV-2抗体的中和能力进行评价,测试该方法的可靠性。优化结果表明,当使用LipofectamineTM3000作为转染试剂时,pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP?psPAX2?pcDNA3.1-S以0.300μg?0.225μg?0.240μg的质量比转染获得的假病毒滴度最高。进一步,发现利用该方法包装的三种突变株的假病毒均可达到较高滴度。利用该方法制备的假病毒可以用于SARS-Co V-2抗体的中和活性检测,测得IC50值为0.126μg/m L。该研究成功建立了一种简单高效的制备新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒的方法,其可用于体外评估SARS-CoV-2抗体中和活性,为研发SARS-CoV-2相关疫苗和药物的体外评价提供了技术基础。

猪细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为研究miRNA在猪细小病毒（PPV）复制中的作用机制,针对PPV的NS1基因设计引物,建立了实时荧光定量PCR;用RegRNA软件和RNAhybrid软件预测能靶向PPV基因组的miRNA,将筛选出的miR-34a与miR-181a、miR-16、miR-499-5p、miR-10b、miR-18a、miR-145-5p分别转染到PK-15细胞,然后用PPV感染细胞,每隔12h取细胞上清,用实时荧光定量PCR检测PPV的DNA拷贝数。结果显示,实时荧光定量PCR的最适退火温度为59℃,熔解温度在85℃左右,质粒浓度在1.59×10^9~1.59×10^4 copies/μL时可得到较为理想的标准曲线,相关系数为0.997,扩增效率为97.2%。用该实时荧光定量PCR对日本脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型进行检测时均无荧光信号,表明具有良好的特异性。转染不同miRNA的细胞感染PPV后,用建立的实时荧光定量PCR检测发现miR-34a能抑制PPV的复制,其他miRNA对PPV增殖无明显影响。

猪流行性腹泻病毒感染PK-15细胞miRNA的差异表达分析

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diahorrea virus,PEDV)对猪肾传代细胞PK-15miRNA表达谱的影响,将PEDV感染PK-15细胞后,提取总RNA,进行高通量测序,构建感染与未感染PEDV的PK-15细胞的miRNA表达谱,并进行差异性分析,对表达差异显著的miRNA进行heatmap聚类分析及GO(Gene ontology,GO)分子功能(Molecular function,MF)分析,选取10个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行了验证。结果发现,显著性差异表达的miRNA有214个,其中175个miRNA表达上调,39个miRNA表达下调。Heatmap聚类分析表明,病毒组绝大部分差异表达的miRNA较对照组表达量上调,少部分下调。GO分析表明,miRNA广泛参与结合、蛋白结合、蛋白激酶活性、转移酶活性、含磷基团转移、磷酸转移酶活性等生物作用。RT-qPCR验证的各miRNA的表达趋势与高通量测序结果一致。结果表明,猪流行性腹泻病毒感染对PK-15细胞编码的miRNA表达水平有显著影响,从而对进一步研究治疗PEDV的miRNA制剂提供新思路。

一种基于胶体微晶纤维素的改良病毒蚀斑测定法的建立与评价

胶体微晶纤维素(avicel)是一种由微晶纤维素(microcrystalline cellulose, MCC)和羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,CMC)制成的混合物,可用于病毒蚀斑测定。常用的avicel由FMC公司生产,其MCC和CMC比例相对固定,无法很好地适应所有类型病毒的蚀斑测定实验。本研究通过对比不同的MCC和CMC配制比例对avicel在病毒蚀斑测定作用的影响,建立了一种操作简便、实用性好和稳定性好的改良avicel病毒蚀斑测定法。为了配制不同浓度MCC和CMC的混合物,本研究制备出12种2×avicel覆盖层,测定其总体黏度及底层黏度,评估其与传统覆盖层相比,使用时的操作难易程度。进一步将12种2×avicel覆盖层制备成avicel-DMEM营养覆盖层,测定96孔板中猪流行性腹泻病毒滴度,比较12种avicel覆盖层及传统覆盖层蚀斑大小、清晰度、稳定性及滴度准确性等的差异,筛选出最佳测定方法。结果显示,12种2×avicel覆盖层中,除4.8%MCC+1.4%CMC和4.8%MCC+1.0%CMC外,其余2×avicel覆盖层在实际使用中均比2×CMC覆盖层更容易吸取和配制营养覆盖层。最后,利用avicel病毒蚀斑测定法测定96孔板中猪流行性腹泻病毒滴度,结果显示CMC浓度越高蚀斑越小,其中终浓度为0.6%MCC+0.7%CMC的avicel覆盖层测定蚀斑染色最清晰,准确度与传统覆盖层相似,但操作较传统覆盖层更简便。综上所述,本研究建立了一种操作简便、实用性好和稳定性好的改良avicel病毒蚀斑测定法,为病毒的病原学、抗病毒药物及疫苗等相关研究的展开提供了良好的实验基础。

高效构建卵清白蛋白scFv噬菌体文库及其筛选

目的:建立一种高效噬菌体文库构建方法,获得抗鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的单链抗体(scFv)噬菌体展示文库,筛选鉴定获得OVA单链抗体。方法:用OVA蛋白免疫Balb/C小鼠,选取血清抗体效价高的小鼠提取脾脏RNA,利用RT-PCR方法扩增获得小鼠重链和小鼠轻链基因。通过无缝连接酶一步将小鼠重链基因、轻链基因和linker DNA连接起来,插入噬菌体表达载体中,构建OVA scFv噬菌体展示文库。测定文库容量,对文库进行富集筛选,ELISA鉴定阳性克隆,测序后构建真核表达载体,转入Expi-CHO悬浮细胞进行真核表达,利用Western blot进行鉴定。结果:成功获得库容量为1. 2×10^7cfu的OVA scFv噬菌体展示文库,并从中筛选出8个阳性克隆,选取效价最高的2号克隆,在Expi-CHO悬浮细胞中表达获得可溶性抗体。结论:建立了一种高效构建scFv噬菌体文库的方法,筛选获得高结合活性的OVA单链抗体,并成功进行了真核表达,为OVA ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。

不同固定液对Vero E6细胞形态和染色的影响及在病毒噬斑分析中的应用

病毒噬斑形成实验是确定病毒滴度的重要方法,其中噬斑染色是非常关键的步骤,而良好的固定液不仅能够维持细胞形态,也能起到助染作用,是有效识别病毒噬斑的关键因素。为了研究不同固定液对Vero E6细胞形态和结晶紫染色效果的影响,本研究采用五种固定液对Vero E6细胞进行固定(100%甲醇、4%甲醛、10%甲醛、75%乙醇和95%乙醇)。以只加PBS缓冲液的细胞作为对照组。细胞固定30 min后利用1%结晶紫进行染色。利用光学显微镜和肉眼观察细胞形态,从而评价固定和染色效果。结果显示,10%甲醛的细胞固定效果最佳,细胞形态良好,细胞染色均匀且着色深,利用该固定剂能在病毒噬斑实验中很好的识别噬斑,是Vero E6较为理想的固定剂。

稳定表达hACE2的293T细胞系的建立及功能分析

该研究旨在利用hACE2真核表达载体,通过电转法获得具有新型冠状病毒易感性的稳定表达hACE2的293T细胞株。将线性表达质粒pCMV-hACE2电转至293T细胞,经潮霉素B筛选后,利用间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、Western blot、流式分析法鉴定hACE2的表达,S-RBD蛋白和SARS-CoV-2假病毒分析细胞功能活性。利用250 μg/mL潮霉素B筛选获得了稳定高表达hACE2的细胞系293T-hACE2-D4。在该细胞中,RT-PCR检测到了大量hACE2基因的mRNA,Western blot、间接免疫荧光和流式分析法检测细胞表面hACE2蛋白表达情况(阳性细胞率为86.86%)。功能分析中,293T-hACE2-27-D4细胞不仅能够与SARS-Cov-2 S-RBD蛋白相结合(结合率达84.26%),并且能够成功感染新型冠状病毒假病毒。该研究构建的稳定表达hACE2的293T细胞不仅能与S-RBD蛋白结合,还对新冠假病毒具有易感性,是探究病毒感染机制的有利工具。

稳定表达小鼠CD40L的NIH3T3细胞系的建立及其在B细胞培养和激活中的应用

该研究构建小鼠CD40L真核表达重组质粒pcDNA3.1-mCD40L,通过电转法将重组质粒转至NIH3T3细胞中。利用G418对转染后细胞进行压力筛选,获得稳定转染细胞株。提取稳定转染细胞株RNA,通过RT-PCR法检测Neo基因的mRNA表达情况。分离稳定转染细胞上清,利用ELISA法检测小鼠CD40L蛋白水平的表达情况。RT-PCR结果显示,Neo基因能够在稳定转染细胞中表达,ELISA结果显示,获得的稳定转染细胞株NIH3T3-mCD40L细胞上清中CD40L的表达量高达1.286 ng/mL。进一步活性研究表明,该细胞系能够在体外与IL-2和IL-21共同作用培养B细胞至14天,并刺激B细胞产生特异性抗体。该细胞系的成功构建,为利用体外B细胞分离培养和活化法分离特异性单克隆抗体奠定了良好的基础。

人可溶性CD105蛋白的真核表达及纯化

目的建立一种简便、高效的人可溶性CD105(soluble CD105,sCD105)蛋白的真核表达及纯化方法。方法人工合成胞外区和信号肽区域的DNA片段,在其信号肽前端加入Kozak sequence(GCACCATGG)序列,促进蛋白表达,同时在其C-末端6×His前加入K(AAG)氨基酸,促进6×His的暴露有助于后期纯化,构建真核表达质粒pcDNA3. 4-sCD105。通过瞬时转染的方法将重组质粒转染293F悬浮细胞,收集细胞上清液,利用His-trap EXCEL柱通过两步纯化法进行纯化。将纯化获得的sCD105蛋白超滤浓缩后,进行10%SDS-PAGE、Western blot及ELISA检测。结果在20mL(1×10^6个/mL)293F悬浮细胞中表达及纯化后,获得纯度>95%的sCD105蛋白3mL,浓度为27.83mg/L,获得率高达4.17mg/L。结论成功建立了一种简便高效的sCD105蛋白表达及纯化的方法,为后期蛋白功能的研究及相应治疗或诊断性抗体的开发奠定了基础。