香叶树种子休眠与萌发特性的研究

为了研究低温层积处理在打破种子休眠、促进萌发过程中的作用机理,对层积不同时间的种子进行生活力和抗氧化酶系统测定、胚轴发育观察、抑制物检测。结果表明:随着香叶树种子层积时间的增长,种子萌发力及抗氧化酶活性均呈逐渐增加的趋势,而丙二醛含量呈不断下降的趋势;层积过程中水分条件的变化对层积结果有较大影响;香叶树的萌发抑制因素主要来源于种皮的内源抑制物,种胚存在后熟作用,而低温层积处理对香叶树种子较快打破休眠具有重要的生理作用。

甜菊醇糖苷生物合成关键基因的导入和鉴定分析

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)生产的甜菊醇糖苷因具有高甜度、低热能、不参与人体内代谢兼具保健功能等特点,被誉为最有发展前途的新糖源。从甜叶菊叶片克隆了甜菊醇糖苷生物合成途径中的关键基因SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G1,构建植物基因过量表达载体,以单独或组合的形式将这些基因导入到甜叶菊中,获得转基因植株。与野生型对照植株相比,单独导入SrUGT85C2的转基因植株中甜菊醇单糖苷含量提高,总糖苷、莱包迪苷A含量及占比没有明显变化;单独导入SrUGT91D2m的转基因植株中甜菊醇单糖苷含量显著降低,而甜菊醇双糖苷含量显著增加;单独导入SrUGT76G1的转基因植株中,总糖苷含量显著提高,莱包迪苷A含量达到10%以上,比对照提高了2倍,而甜菊糖苷含量减少了一半。3个基因组合同时导入的转基因甜叶菊植株与单独导入SrUGT76G1的转基因甜叶菊植株类似,其总糖苷、莱包迪苷A含量及其占比均显著提高。这些结果为以后通过分子生物学技术来调控甜菊醇糖苷生物合成关键基因的表达,培育莱包迪苷A含量高的高品质甜叶菊新品系提供了理论依据和技术方法。

利用微型离心管提取分析天然橡胶主要成分聚异戊二烯方法的建立

为建立一种快速、准确的从少量样品中提取、分析天然橡胶主要成分聚异戊二烯含量的方法,在已采用索氏提取器提取的基础上,进一步探讨采用2 mL微型离心管的方法提取分析材料(0.5 g以下)中的聚异戊二烯含量。从分别利用微型离心管与索氏提取器提取4种样品分析材料,即顺式聚异戊二烯标准品、多汁乳菇子实体、杠柳枝条、杜仲果翅的提取得率和分子量分布看,2种提取方法的差别不大,再通过每次提取时利用顺式聚异戊二烯标准品建立标准曲线校正,采用2 mL微型离心管微量提取分析测定植物植株、组织材料或真菌子实体、菌丝体中的顺式或反式-1、4-聚异戊二烯橡胶含量的方法可行、结果可信。

赤霞珠葡萄果实苹果酸生物合成关键转录因子的筛选与鉴定

该研究以宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄种植区栽培面积最大的‘赤霞珠’为材料,在前期完成从果实形成至成熟不同发育时期的转录组测序以及关键有机酸含量测定基础上,进一步通过转录因子结合位点预测、差异表达基因分析、加权基因共表达网络关联分析(WGCNA),逐步筛选出与‘赤霞珠’果实苹果酸生物合成相关功能基因特异结合的、影响苹果酸生物合成的相应转录因子,并对其进行qRT-PCR验证,以揭示这些关键功能基因及其关键转录因子在葡萄不同种植区、果实不同发育时期存在的相互调控作用机制,为以后培育优质酿酒葡萄提供新的理论依据与思路。结果表明:(1)GC/MS分析发现,‘赤霞珠’果实在4个发育时期的延胡索酸和苹果酸含量变化趋势基本一致,两种酸含量均从果实硬果期到绿果期逐步升至最高(3.63和626.53μg/g),之后缓慢下降,经转色期到成熟期后逐渐降至最低(2.14和244.26μg/g),而草酰乙酸的变化趋势却相反,在硬果期含量最高(315.54μg/g),经绿果期、转色期到成熟期逐渐降至最低值(126.11μg/g)。(2)‘赤霞珠’果实发育时期样本转录组测序共获得可能与苹果酸生物合成途径12种功能基因结合的转录因子6411个,其中延胡索酸水化酶(FH)的3个功能基因有86个转录因子,苹果酸脱氢酶(MDH)的10个功能基因有717个转录因子。(3)转录组测序数据及其与有机酸含量WGCNA关联结果的Veen分析确定了‘赤霞珠’果实成熟过程中与苹果酸生物合成相关度最高的3个FH基因(VIT_14s0060g01700、VIT_13s0019g03330、VIT_07s0005g00880)、2个MDH基因(VIT_10s0003g01000、VIT_13s0019g05250)及相应的18个关键转录因子。(4)qRT-PCR验证及相关性分析表明,FH基因VIT_13s0019g03330与其转录因子VIT_01s0011g06200、VIT_08s0056g01230以及MDH基因VIT_13s0019g05250与其转录因子VIT_06s0004g04960、VIT_10s0003g02070的表达水平与苹果酸的积累存在显著正相关关系,推测这4个关键转录因子可能通过调控功能基因的转录,综合影响‘赤霞珠’果实苹果酸的生物合成。

甜叶菊中9种甜菊醇糖苷积累与其生物合成关键基因表达量的相关性

为了研究甜叶菊中主要甜菊醇糖苷积累特点与其生物合成关键基因表达量的关系,本研究选取3个品种甜叶菊(普赛科3号、中山2号、同心)为试验材料,定期在幼苗期、营养生长期、花蕾期采收植株的上位3对叶片,采用液相色谱-质谱法(LC-MS)检测9种甜菊醇糖苷,即莱宝迪苷A、B、C、D、E、F(RA、RB、RC、RD、RE、RF)、甜菊糖苷(ST)、甜茶糖苷(RBS)和杜尔可苷A(DA)含量,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析糖苷生物合成的3个UDP-糖基转移酶(UGTs)关键基因,即SrUGT91D2e、SrUGT74G1和SrUGT76G1的表达水平。结果表明,甜味糖苷RA在普塞科3号营养生长期含量最高(1.60 mg·g^(-1)),RD在普塞科3号的花蕾期含量最高(1.58 mg·g^(-1));苦味糖苷ST、RC、DA在普塞科3号中的积累量显著低于中山2号和同心(普塞科3号ST为0.50 mg·g^(-1)、RC为0.26 mg·g^(-1)、DA为0.01 mg·g^(-1)),因此普塞科3号可作为甜味糖苷高产选育品种。对甜菊醇糖苷生物合成关键基因表达量与糖苷含量进行相关性分析,甜味糖苷RD和RA的含量与其关键影响因子SrUGT91D2e和SrUGT76G1的表达量显著相关,苦味糖苷RC、ST、DA的含量与其关键影响因子SrUGT74G1的表达量显著相关。本试验为甜叶菊不同甜度糖苷的品种选育及采收时间的确定提供了依据。

黑果枸杞高效植株再生与遗传转化体系的建立

为建立高效的黑果枸杞组织培养与遗传转化体系,本研究以黑果枸杞叶片、茎节、茎段为外植体,在含有不同浓度组合的NAA和BAP培养基上进行愈伤组织和不定芽诱导比较;选择黑果枸杞叶片为材料,采用农杆菌介导法,将带有绿色荧光蛋白基因(sGFP)的双元表达载体导入黑果枸杞,探讨侵染时间和抗生素浓度对遗传转化效果的影响。结果表明,黑果枸杞的最适植株再生体系为:以叶片为外植体,MS基本培养基中添加0.5 mg·L^(-1)NAA和0.3 mg·L^(-1)BAP,愈伤组织诱导率为88.56%,不定芽诱导率为54.54%,将不定芽置于1/2MS培养基中进行生根诱导,生根率为95%;稳定高效的遗传转化体系为:农杆菌侵染液OD_(600)为0.25,共培养3 d,卡那霉素(kanamycin)和羧苄西林(carbenicillin)浓度分别为25和250 mg·L^(-1)。愈伤组织和不定芽诱导时经卡那霉素和荧光标记双重选拔,愈伤组织阳性率为85.47%,出芽生根后经PCR鉴定,阳性转化率为29%;利用实时荧光定量PCR检测转基因植株,导入的外源sGFP基因均有较高的表达水平。本研究为利用基因工程技术对黑果枸杞进行品种改良提供了技术支撑。

保水剂包衣对柠条种子萌发及幼苗生长的影响

使用5种保水剂(A、B、C、D、E)做为添加剂,研究了在干旱条件下,5种保水剂丸化包衣对柠条种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明:不同水分条件对柠条种子发芽率有显著影响,不同保水剂吸水倍数差异显著;保水剂可以显著提高种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数及幼苗生长量,促进程度与保水剂吸水倍数呈正相关;使用保水剂包衣后,萌发中种子的电导率、丙二醛(MDA)含量、过氧化氢(H2O2)含量、脯氨酸含量、过氧化物酶(POD)活性明显低于对照组。综合实验结果,5种保水剂包衣处理效果依次为:D>E>B>A>C。

杠柳顺式-1,4-聚异戊二烯生物合成关键基因PsIPPI和PsCPT的克隆及功能分析

天然橡胶是事关国计民生和国家安全的重要战略物资,其主要成分为顺式-1,4-聚异戊二烯,主要产自巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)。由于受到该树种热带生长特性限制,我国适合种植的区域有限,产能严重不足,开发新的天然橡胶资源已成为迫切需要解决的问题。杠柳(Periploca sepium)乳管分泌的乳汁含有顺式-1,4-聚异戊二烯,非常适用于我国作为天然橡胶生产的替代植物。通过对杠柳树枝(包括皮、枝、叶)进行转录组测序,成功克隆了两个对顺式-1,4-聚异戊二烯生物合成起关键作用的基因PsIPPI和PsCPT,即异戊烯基二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase, IPPI)和顺式-异戊二烯基转移酶(cis-prenyltransferase, CPT)基因;以杠柳茎段为外植体,通过农杆菌介导的转化,将这两个基因以单独或组合形式在杠柳植物体内过表达,结果发现其基因相对表达量最高可增加200倍以上,但单独过表达PsIPPI的转基因植株,其聚异戊二烯含量和分子量分布没有明显变化;单独过表达PsCPT的转基因植株,其聚异戊二烯含量增加了约5倍,且高分子部分的比例提升了约1.6倍;同时过表达PsIPPI和PsCPT的转基因植株,其聚异戊二烯含量增加了5~6倍,高分子部分的比例提升了约2倍。本研究对杠柳顺式-1,4-聚异戊二烯生物合成关键基因的功能做了初步分析,证实利用部分关键基因的过表达可以提高杠柳的天然橡胶产量和高分子量的比例。随着对杠柳有关顺式-1,4-聚异戊二烯生物合成机制、编码各种酶系的关键基因的不断挖掘,可望将杠柳培育成为生产天然橡胶的替代植物,为解决我国天然橡胶贫乏的工业瓶颈和丰富橡胶资源提供技术支撑。