人表皮发生的机制研究:C/EBP在调控体内外角质形成细胞分化中的作用

目的:探讨CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancerbindingprotein,C/EBP)参与表皮角质形成细胞分化调控的作用。方法:①应用免疫组化的方法检测胚胎表皮中C/EBP的表达情况;②通过调节培养的鼠表皮角质形成细胞培养基中钙离子浓度,在不同时间段应用免疫细胞化学检测C/EBPα和C/EBPβ的表达情况。结果:C/EBPα和C/EBPβ主要表达在胚胎期表皮棘层、颗粒层和角质层细胞的胞核内。在培养的角质形成细胞胞核中随分化进行表达增强。结论:说明C/EBP参与表皮角质形成细胞分化调控。

CCAAT/增强子结合蛋白在皮脂腺发育中的表达及意义

目的 检测皮脂腺中C/EBPα和C/EBPβ的表达,探讨其与皮脂腺分化的关系。方法 利用RT PCR和免疫组化染色,分别检测C/EBPα和C/EBPβmRNA及蛋白在胚胎和成人皮脂腺中的表达情况。结果 C/EBPαmRNA的表达在胚胎期较弱,随着分化的进行逐渐升高。C/EBPβmRNA的表达则维持在同一水平。免疫组化检测到C/EBPα和C/EBPβ在胚胎期皮脂腺细胞核内均有表达,在成人皮脂腺则表达在基底层细胞的胞核内。结论 C/EBPα和C/EBPβ的蛋白表达与皮脂腺分化密切的关系。

皮脂腺细胞体外培养及生长调节的研究进展

皮脂腺是皮肤重要的附属器。皮脂腺体外培养模型的建立为研究相关因子如细胞因子、生长激素及药物等对皮脂腺形态功能、生长发育及病理改变的作用提供了良好的平台。本文对皮脂腺细胞体外培养的实验方法、体外生长特性及影响皮脂腺细胞增殖分化的相关因素作简要综述。

重组人源抗HBsAg单链抗体的纯化及亲和常数测定

目的 :对融合 6×His标签的人源抗乙型肝炎表面抗原单链抗体的包涵体进行纯化和复性 ,并对复性产物的抗原结合性质进行鉴定。方法 :工程菌表达的包涵体裂解后 ,金属螯合亲合层析纯化 ,然后以尿素透析、盐酸胍透析和金属螯合亲和层析柱原位复性 3种方法进行复性 ;复性产物以免疫亲和层析精制 ,非竞争酶免疫法测定亲和常数结果 :盐酸胍透析复性产物的比活性最高 ,蛋白回收率为 (6 1 0 8± 1 4 5 ) % ;精制后的重组单链抗体的亲和常数为 (2 30± 0 32 )× 10 7L/mol。结论 :本株单链抗体可以应用优化的透析复性技术 ,在体外高效复性 ,其抗原结合性质不受N末端纯化标签的影响。

人源性抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达及活性测定

目的 :制备有活性的人源性抗HBsAg单链抗体。方法 :应用噬菌体表面呈现技术获得人抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗体的Fab片段 ,并将VH 和VL 基因以 (Gly4Ser) 3linker连接成单链 ,插入表达载体pQE40 ,筛选大肠杆菌高表达菌株。结果 :工程菌表达优化试验表明 ,在OD6 0 0 为 0 6时开始诱导 ,持续 6h ,目的蛋白表达量最高可达菌体总蛋白的 31%。包涵体变性后上样镍离子螯合层析柱一步纯化 ,收集目的峰 ,透析复性 ,得纯度为 97%的重组单链抗体 ,其亲和常数为 0 2 3× 10 8mol L。结论 :抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌内获得高效表达 ,经变性和复性 ,得到有活性的单链抗体 ,氨基酸组成正确。为进行临床前研究打下基础。

抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2融合蛋白的构建与序列测定

目的:构建以人抗乙肝表面抗原（HBsAg）单链抗体（ScFv）为导向作用,白细胞介素-2（IL-2）为治疗作用的融合蛋白原核表达载体pQE 40/ScFv-IL-2。方法:应用PCR技术将抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2在分子水平上进行基因重组,构建中间载体pGEM7Zf（+）/ScFv-IL-2,经酶切鉴定及序列测定正确后,将目的基因片段克隆到pQE 40表达载体中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约4.3×104Da处,可见蛋白表达带。以鼠抗人IL-2单克隆抗体经免疫印迹验证,该表达蛋白为所设计的融合蛋白。结论:融合蛋白ScFv-IL-2的成功构建及表达,为融合蛋白的纯化和研究开发新型的乙肝导向治疗的基因工程药物打下良好的基础。

重组人抗HBs-Fab抗体的纯化及结构分析

目的研究重组人抗HBs-Fab抗体的纯化工艺,并对其结构等特性进行分析。方法采用离子交换-分子筛层析法分离纯化由酵母工程菌(GS115/Fab)发酵的重组人抗HBsAg Fab抗体,并经ELISA检测其抗体活性,等电聚焦电泳法检测其等电点(pI),基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测其相对分子质量和肽质量图谱。结果纯化的重组Fab抗体的纯度可达90%以上,经Sephacryl-100进一步层析后,纯度达99%以上,总收率可达80%以上。Fab抗体具有较好的抗体活性,其pI值为7·6,为一碱性蛋白,相对分子质量为50494,比其理论值约多2579·35,经Endoglycosidase H内切酶消化后的相对分子质量为49609,证明Fab的一级结构中有糖基化现象,且分布于Fab抗体的H链和L链上。胰酶酶解肽段中有21个与理论肽段相符,另检测到1对二硫键正确。结论已建立了重组人抗HBs-Fab抗体的稳定的纯化工艺,且Fab抗体的一级结构正确。

Survivin对辐射损伤的影响及与caspase-9/6、3的关系

目的 观察survivin对辐射损伤的影响及与caspase 9 6、3的关系。方法 ①将IEC 6细胞放置于 2 %O2 环境中低氧 8h后 ,复氧 2 4、48h ,采用Western blot检测胞内survivin ;②给予不同实验组IEC 6细胞 3 5Gy6 0 Co辐射照射 ,采用细胞流式PI法检测细胞凋亡率 ,并使用荧光免疫检测试剂盒检测各组caspase 9 6、3活性。结果 低氧预处理方法可诱导IEC 6细胞表达survivin ,Survivin可明显降低辐射诱导的细胞凋亡率 (P <0 .0 1) ,其对caspase 9 6活性无明显影响 (P >0 0 5 ) ,可使caspase 3活性有明显下降 (P <0 .0 1)。结论 低氧预处理方法诱导的抗凋亡蛋白survivin是通过抑制caspase 3的活性 。

内源性保护蛋白Survivin对辐射诱导细胞凋亡的抑制作用

目的:抗凋亡蛋白Survivin对辐射诱导的细胞凋亡表现出很强的抑制作用。采用低氧预处理方法,诱导IEC-6细胞表达Survivin,观察其对辐射诱导的细胞凋亡的影响,并研究其可能机制,可为放射病的防护提供新的方法和实验依据。方法:分为空白组,单纯放射组,低氧+放射组和拮抗组4组。①将IEC-6细胞置于20mL/LO2环境中低氧6,8,12h,复氧24,48h,用Western-blot检测Survivin。②给予各实验组35Gy60Co照射,采用琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段化,及采用细胞流式PI法检测细胞凋亡率。结果:低氧预处理后出现Survivin蛋白沉积带,以低氧预处理8h复氧48h组最明显。拮抗组、单纯放射组出现典型的DNA片段梯现象,低氧+放射组明显轻于上述两组。单纯放射3h凋亡率由1.44±0.08升高到8.57±0.27,6h达到凋亡高峰24.44±0.32。低氧+放射组凋亡率在3h仅为6.33±0.19,6,12,24h凋亡率明显低于单纯放射组。拮抗组凋亡率明显高于低氧+放射组。结论:低氧预处理可诱导内源性保护蛋白Survivin表达,Survivin可减轻辐射诱导的细胞DNA损伤,同时明显降低辐射诱导的细胞凋亡率。

军队全科医学教育的研究

目的 探讨军队全科医学教育的方法和形成。方法 将部队基层医疗卫生保健机构从军队医疗卫生专业机构中分化出来 ,成为一类新的功能单位。结果 将大大提高部队基层医疗卫生工作的地位 ,增强人们对其的重视程度。目前部队基层医务卫生人员的知识结构和专业技能还不能适应基层卫生工作的性质和要求。发展军队的全科医学 ,建立全科军医专业。结论 是发展部队基层卫生事业 ,提高基层卫生工作质量的重要措施。

人源性抗HBsAg噬菌体抗体的筛选及纯化

目的:获得人源性抗HBsAg抗体Fab片段。方法:用预包被HBsAg的ELISA板,从构建的人全套抗体库中筛选出针对HBsAg的噬菌体抗体。并转入大肠杆菌中表达。破裂细胞后,获得可溶性Fab片段。以羊抗人Fab抗体偶联HiTrap柱。

基于计算机视觉的早期乳腺癌放射治疗一体化摆位系统研究

目的研究一种基于计算机立体视觉的乳腺癌放射治疗摆位验证的方法,以减少在乳腺癌分次放射治疗中,由于多次摆位、体型变化等因素的影响造成肿瘤位置动态位移引起治疗误差。方法使用由双摄像机组成的计算机视觉系统,准确匹配出多个特征标记物在左右两摄像机采集的图像中的具体坐标,依据双目成像的基本原理计算出各标记物在胸腹部表面特征点的三维坐标值,构建出乳房及胸部体表的立体特征形状,以此来完成在分次放射治疗前摆位准确性的在线判定。在算法设计过程中,采用动态选择待匹配图像和局部搜索的策略,目标图像匹配精确。结果调试实验表明,系统能够准确提供各标记点的三维空间位置,并且能够做到实时性计算。结论基于计算机立体视觉的乳腺癌放射治疗摆位系统能够为放射治疗摆位提供一定的定位数据指导。

预处理的迟发性保护作用

缺血预处理诱发迟发性保护作用发生于预处理后 2 4～ 72 h。腺苷和 NO可能是两种独立的保护作用启动因子。通过激活 PKC酶、酪氨酸激酶和 p38MAP酶 ,促使 HSP 2 7、Mn- SOD等蛋白合成及磷酸化 ,最终发生迟发性保护效应。 KATP是缺血预处理迟发性保护作用的重要中心环节 。

山竹子根乙醇提取物的体外抗HBV作用

采用HBV DNA转染细胞(2.2.15细胞)为靶细胞,用Ara—Amp为阳性对照药,观察在不同浓度下山竹子根95％乙醇提取物对2.2.15细胞表达HBsAg、HBeAg的影响。结果表明:山竹子根95％乙醇提取物在195～780μg/ml的浓度范围内,对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg有抑制作用。

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。

抗HBsAg单链抗体特异性单克隆抗体的制备及应用

目的获得抗HBsAg单链抗体（HBScFv）的单克隆抗体，并初步研究其在抗HBsAg类小分子抗体及其融合蛋白质的纯化、活性鉴定方面的应用。方法利用杂交瘤技术，以大肠杆菌表达的重组抗HBScFv为抗原，免疫Balb／c小鼠，再将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行细胞融合。通过ELISA法、Western—blot鉴定特异性单克隆抗体，通过免疫双扩散法鉴定单抗亚型，并将筛选到的高效价单抗用于抗HBsAg Fah抗体等重组蛋白质的亲和色谱及ELISA鉴定。结果建立了9株能够稳定分泌抗HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株，其细胞上清效价为1：160～1：12800．腹水效价为1：50000～1：400000；单克隆抗体的亚类分析结果显示有6株为IgGl，其余3株为IgG2a。初步应用结果表明制备的单克隆抗体14F7可用于抗HBsAgFah抗体等重组蛋白质的亲和色谱及活性鉴定。结论成功建立了能够稳定分泌HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株。