Beclin 1增强三阴性乳腺癌BT-549细胞对紫杉醇的敏感性

目的:研究Beclin 1对于三阴性乳腺癌BT-549细胞对紫杉醇的敏感性的影响。方法:应用慢病毒介导Beclin 1表达载体转染BT-549细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞;MTT法检测各组细胞的增殖抑制率;流式细胞术和Hoechst33342染色法检测细胞凋亡情况;吖啶橙染色法检测细胞内酸性囊泡形成情况。结果:成功构建稳定表达Beclin 1的BT-549细胞;紫杉醇作用24 h,Beclin 1组的IC50为(416.85±16.97)μg/L,显著低于空载体组(1725.43±99.70)μg/L和未转染组(2130.10±190.74)μg/L(F=154.847;P<0.00);作用48 h,Beclin 1组IC50为(74.48±10.18)μg/L,显著低于空载体组(280.18±14.78)μg/L和未转染组(614.80±9.29)μg/L(F=1638.484;P<0.00);50μg/L紫杉醇处理48 h,Beclin1组BT-549细胞凋亡率为(46.40±1.00)%,显著高于空载体组(37.81±1.85)%和未转染组(35.55±3.36)%(F=14.661;P<0.005),Beclin 1组细胞细胞核凋亡特征改变较其他两组更明显;紫杉醇处理后,Beclin 1组细胞酸性囊泡形成显著多于其他两组。结论:Beclin 1显著增强三阴性乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性。

腹腔镜手术对胃肠间质瘤患者围术期指标及并发症的影响研究

目的 对胃肠间质瘤患者给予腹腔镜手术治疗,分析其围术期指标及对并发症的影响。方法 选取2018年6月至2021年6月在本院治疗的胃肠间质瘤患者68例,按照手术方法分为观察组与对照组各34例,给予观察组腹腔镜手术治疗,给予对照组开腹手术治疗,对两组围术期相关指标、手术前后胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)、胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)、胃泌素水平、术后并发症及预后情况进行统计比较。结果在围术期指标方面,观察组手术时间(78.06±5.52) min、术中出血量(70.12±15.64) mL、术后排气时间(1.94±0.51) d、术后进食时间(2.61±0.74)d、术后下床活动时间(2.51±0.34) d及住院时间(6.98±1.28) d,与对照组手术时间(94.56±9.29) min、术中出血量(87.57±19.58) mL、术后排气时间(3.69±1.17) d、术后进食时间(4.52±1.38)d、术后下床活动时间(4.59±0.51) d及住院时间(8.67±1.49) d比较均明显缩短,差异有显著性(P<0.05);在术后并发症方面,观察组总发生率5.9%显著低于对照组23.5%(P<0.05);在PGⅠ、PGⅡ、胃泌素水平方面,观察组术后各指分别为(153.69±17.29)μg/L、(9.48±2.15)μg/L、(91.59±10.31)μmol/L,对照组术后各指分别为(143.62±15.23)μg/L、(10.57±1.79)μg/L、(80.57±8.36)μmol/L,两组PGⅠ、胃泌素术后水平均较术前水平显著提高,PGⅡ较治疗前显著降低,其中观察组术后改善水平显著优于对照组(P<0.05);在预后方面,观察组复发率与转移率与对照组比较均无明显差异(P>0.05)。结论 对胃肠间质瘤患者给予腹腔镜手术治疗可取得显著的效果,创伤小,有助于患者术后恢复,可促进恢复胃肠功能恢复,降低术后并发症,有助于预后。

Beclin 1蛋白增强三阴性乳腺癌细胞对5-Fu敏感度的研究

目的探讨Beclin 1蛋白与三阴性乳腺癌细胞对5-Fu敏感度的关系。方法应用慢病毒介导p Len O-GTP-BECN1表达载体稳定转染至BT-549细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞,设立对照组。使用不同浓度5-Fu处理各组细胞,MTT法比较细胞对5-Fu的敏感度;流式细胞术和Hoechst33342实验检测细胞凋亡情况;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-8表达情况。结果成功构建稳定表达Beclin 1蛋白的BT-549细胞株。p Len O-GTP-BECN1组对5-Fu敏感度显著高于其他两组;5-Fu作用48 h后,p Len O-GTP-BECN1组的IC50为(3.54±0.20)μg/ml,显著低于空白载体p Len O-GTP组(14.45±1.81)μg/ml和空白组(79.40±8.34)μg/ml(F=207.902;P<0.00)。5-Fu作用前,p Len O-GTP-BECN1组凋亡率为(12.14±0.76)%,同p Len O-GTP组(13.57±1.04)%和空白组(13.75±1.29)%(F=2.096;P=0.204)之间差异并无统计学意义;5-Fu作用48 h后,p Len O-GTP-BECN1组凋亡率为(51.01±3.26)%,显著高于p Len O-GTP组(42.17±4.6)%和空白组(38.42±2.93)%(F=9.32;P<0.01);接受5-Fu处理后,p Len O-GTP-BECN1组细胞核凋亡特征改变较其他两组更明显。5-Fu作用后,p Len O-GTP-BECN1组细胞Caspase-3相对表达量为(0.57±0.0028),显著高于p Len O-GTP组(0.42±0.010)和空白组(0.30±0.046)(F=46.134;P<0.01);p Len O-GTP-BECN1组细胞Caspase-8相对表达量为(0.44±0.0038),显著高于p Len O-GTP组(0.18±0.0095)和空白组(0.27±0.00060)(F=1006.757;P<0.00)。结论Beclin 1显著提高三阴性乳腺癌细胞对5-Fu的敏感度,其中促进凋亡发生可能是重要机制之一。

血钙浓度联合MELD评分对肝硬化严重程度的预测价值

肝硬化是消化内科常见病,由慢性肝炎、血吸虫性肝病、酒精性肝病等各种原因引起弥漫性肝脏纤维化、假小叶、肝内外血管增殖为特征的病理改变[1-2]。肝硬化患者肝功能代偿期无明显症状,失代偿期多因出现多种并发症就医,比如低钠血症,目前已证实与肝硬化患者病情的严重程度相关[3]。Child-Pugh分级是评价终末期肝病严重程度指标中比较经典的一项,后来有学者提出终末期肝病模型(MELD)评分系统,该方法操作简单,评价客观多项,在治疗中具有重要的指导意义,但均存在一定的局限性[4-7]。

MTHFR基因C677T多态性对进展期胃癌术后行SOX方案化疗的安全性及预后的影响

目的探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性对进展期胃癌术后行SOX方案(奥沙利铂+替吉奥)化疗的安全性及预后的影响。方法回顾性分析62例胃癌根治术后规范化行SOX方案化疗患者的临床资料。收集术后病理标本行MTHFR C677T多态性分型,分析MTHFR C677T多态性和胃癌术后患者的临床病理特征、化疗不良反应发生的关系。分析MTHFR C677T多态性与化疗血液系统毒性分级的关联,并比较不同基因型的生存率。结果62例中MTHFR C677T多态性基因型分布分别为CC型32例(51.61%),CT型23例(37.10%),TT型7例(11.29%),其基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(χ^(2)=0.806,P=0.369)。后续的分析将CT型和TT型合并,CC型和CT+TT型胃癌患者的临床病理特征分布均衡;CT+TT基因型患者的血液系统毒性发生率高于CC基因型(χ^(2)=7.281,P=0.007),但毒性反应分级差异无统计学意义(Z=0.259,P=0.796);不同基因型不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。MTHFR C677T位点CC基因型与CT+TT基因型的中位无病生存期(DFS)分别为39个月(95%CI:32.71~45.29)和44个月(95%CI:41.05~46.95),3年的无病生存率分别为65.6%和70.0%,差异无统计学意义(χ^(2)=0.496,P=0.481)。CC基因型与CT+TT基因型的中位总生存期(OS)分别为55个月(95%CI:49.85~60.15)和59个月(95%CI:56.59~61.40),3年的总生存率分别为75.0%和83.3%,差异无统计学意义(χ^(2)=0.606,P=0.436)。结论MTHFR基因C677T多态性与进展期胃癌术后行SOX方案化疗的血液系统毒性发生率相关,与血液学毒性分级及患者的预后无关。

短程低氧条件下乳腺癌BT549细胞表达beclin 1基因对上皮间质转化的影响

目的 beclin 1基因慢病毒表达载体稳定感染三阴性乳腺癌BT549细胞后,于短程低氧条件下探讨beclin 1基因对上皮间质转化(EMT)的影响。方法用带有pLenO-GTP Vector及pLenO-GTPbeclin 1 Vector的慢病毒以感染复数(MOI)为20分别感染BT549细胞,即实验对照组及实验组,未感染细胞作为空白对照。感染96 h后用倒置荧光显微镜观察荧光,估计感染效率;用Western blot法检测beclin 1基因是否在BT549细胞中稳定表达;将各组细胞低氧培养12、24 h后采用荧光定量PCR、Western blot法及激光共聚焦显微镜检测EMT相关标志物;用Western blot法检测低氧培养24 h后的各组细胞Wnt/β-catenin信号通路的相关蛋白表达水平。用两样本t检验分析低氧时间对细胞EMT相关标志物的表达情况,余计量资料用方差分析进行统计。结果慢病毒感染BT549细胞96 h后,感染效率约为100%,实验组beclin 1蛋白高效稳定表达(F=107.200,P=0.000);低氧条件下,相对于空白对照组、实验对照组,实验组细胞的上皮标志物E-cadherin mRNA和蛋白表达水平上调(12 h:F=122.451、P=0.000,F=29.651、P=0.001;24 h:F=108.783、P=0.000,F=41.232、P=0.000),而间皮标志物Ncadherin、vimentin及fibronectin表达水平下调(12 h:N-cadherin F=92.918、P=0.000、F=138.034、P=0.000,vimentin F=135.313、P=0.000、F=39.765、P=0.000,fibronectin F=144.275、P=0.000;24 h:Ncadherin F=76.064、P=0.000、F=40.614、P=0.000,vimentin F=206.576、P=0.000、F=46.658、P=0.000,fibronectin F=411.405、P=0.000);相对于低氧培养12 h,各组细胞低氧培养24 h后E-cadherin表达水平下调(空白对照组:t=4.266、P=0.013,t=11.235、P=0.000;实验对照组:t=10.463、P=0.000,t=4.092、P=0.009;实验组:t=28.208、P=0.000,t=7.262、P=0.001),而N-cadherin(实验组除外)、vimentin和fibronectin表达水平上调(空白对照组:N-cadherin t=3.072、P=0.037、t=7.146、P=0.002,vimentin t=6.384、P=0.003、t=7.476、P=0.002,fibronectin t=8.389、P=0.001;实验对照组:Ncadherin t=2.805、P=0.049、t=5.352、P=0.006,vimentin t=12.701、P=0.000、t=5.923、P=0.004,fibronectin t=7.318、P=0.002;实验组:N-cadherin t=7.849、P=0.001、t=1.987、P=0.184,vimentin t=11.097、P=0.000、t=13.626、P=0.000,fibronectin t=11.003、P=0.000);beclin 1基因与低氧环境对BT549细胞E-cadherin、N-cadherin的表达水平有交互效应(E-cadherin:F=19.175、P=0.000,F=5.588、P=0.015;N-cadherin:F=8.238、P=0.006,F=5.934、P=0.016);低氧培养24 h后,实验组Wnt/β-catenin信号通路的β-catenin、Snail蛋白水平下调(β-catenin:F=18.169,P=0.003;Snail:F=11.098,P=0.010),而p-GSK-3β的蛋白水平上调(F=36.096,P=0.000)。结论 beclin 1基因在短程低氧条件下抑制BT549细胞EMT,而随时间的增加低氧促进EMT;beclin 1基因在短程低氧环境下抑制EMT的机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。

转染beclin1基因诱导自噬对三阴性乳腺癌BT-549细胞生长的影响

目的探讨转染beclin1基因诱导三阴性乳腺癌BT-549细胞发生自噬及其对细胞生长的影响。方法将BT-549细胞分为4组,包括空白组、空载体组、脂质体组和目的基因组,并以MDA-MB-231细胞作为阳性对照组。采用Lipofectamine^(TM)2000携带含有beclin1基因的质粒转染BT-549细胞,分别于转染后24、36、48、60h用荧光显微镜观察转染效率;于转染后48h利用RT-PCR检测各组细胞beclin1 mRNA表达情况;转染后各组细胞分别在含10%胎牛血清1640培养基和无胎牛血清1640培养基内培养,并分别于24、48、72、96h和12、24、36、48h采用MTT法检测细胞的增殖率和存活率;各组细胞在无胎牛血清1640培养基内培养24h后,采用流式细胞仪检测其细胞凋亡和细胞周期情况;各组细胞在无胎牛血清1640培养基内生长36h后,经吖啶橙染色观察并比较发生自噬的细胞数。MTT数据按重复测量的方差分析进行统计,其余计量资料按单因素方差分析进行统计,计数资料按照R×C表资料的χ~2检验进行统计分析。结果 48h时携带目的基因的质粒经脂质体转染BT-549细胞的效率最高;目的基因组细胞beclin1 mRNR水平显著高于空白组、脂质体组、空载体组和阳性对照组(P<0.01);在含10%胎牛血清1640培养基内,目的基因组细胞的增殖率显著低于空白组(F=112.1,P=0.00),而在无胎牛血清1640培养基内,目的基因组细胞36h和48h的存活率显著高于空白组(F=37.5,P=0.00);目的基因组细胞的凋亡比例增加(F=3914.4,P=0.00),且细胞处于G0/G1期的比例升高(F=258.8,P=0.00);目的基因组细胞发生自噬的数量显著增加(χ~2=7.7,P=0.00)。结论向三阴性乳腺癌BT-549细胞转染beclin1基因,可提高细胞的自噬水平。该作用可抑制细胞在正常培养环境下的增殖,但对低营养环境下的细胞存活具有保护作用。

X射线修复交叉互补1 Arg399Gln基因多态性对胃癌术后SOX化疗不良反应及预后的预测价值

目的探讨X射线修复交叉互补1(XRCC1)Arg399Gln基因多态性对进展期胃癌D2根治术后SOX方案(奥沙利铂130 mg/m^(2)静脉滴注第1天,替吉奥40 mg/m^(2)口服2次/d,第1~14天,每21 d重复)化疗的不良反应及预后的预测价值。方法回顾性分析2015年1月至2018年4月在衢州市人民医院胃肠外科收治的62例进展期胃癌D2根治术后实施SOX方案辅助化疗患者的临床资料。收集术后病理标本行XRCC1 Arg399Gln多态性基因分型检测,分析XRCC1 Arg399Gln多态性与胃癌术后患者的临床病理特征、化疗不良反应发生的关系,并比较不同基因亚型的无病生存期(DFS)及总生存期(OS),Cox回归分析筛选预后危险因素。结果62例胃癌患者中XRCC1 Arg399Gln基因亚型分布分别为G/G型35例(56.45%),G/A型21例(33.87%)及A/A型6例(9.68%),XRCC1 Arg399Gln基因亚型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P=0.295)。后续的分析将G/A型和A/A型合并,G/G型和G/A+A/A型患者的临床资料分布均衡,不同基因亚型与SOX方案辅助化疗的各项不良反应无相关性。XRCC1 Arg399Gln位点G/G基因型与G/A+A/A基因型的中位DFS分别为45个月(95%CI 41.73~48.28)和38个月(95%CI 35.71~40.29),差异有统计学意义(P=0.047);单因素Cox回归分析显示XRCC1 Arg399Gln多态性(RR=2.178,95%CI 1.078~4.402,P=0.030)是进展期胃癌术后行SOX方案化疗患者肿瘤复发的危险因素;多因素Cox回归及校正分析显示,XRCC1 Arg399Gln多态性(RR=2.581,95%CI 1.242~5.363,P=0.011)是进展期胃癌术后实施SOX方案化疗患者肿瘤复发的独立危险因素。XRCC1 Arg399Gln位点G/G基因型与G/A+A/A基因型的中位OS分别为60个月(95%CI 57.81~62.19)和55个月(95%CI 49.62~60.38),差异无统计学意义(P=0.202);单因素Cox回归分析显示XRCC1 Arg399Gln多态性(RR=1.702,95%CI 0.744~3.896,P=0.208)不是进展期胃癌术后实施SOX方案化疗患者死亡的危险因素。结论XRCC1 Arg399Gln基因多态性与进展期胃癌术后SOX方案化疗的不良反应无相关性,但XRCC1 Arg399Gln G/G型与进展期胃癌术后SOX方案化疗患者预后密切相关,且对DFS有较好的预测价值。

正常和低氧环境下转染beclin-1对乳腺癌细胞BT-549的抑制作用

目的研究转染beclin-1基因对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞BT-549在正常及低氧环境下的增殖抑制情况,促自噬和促凋亡作用,以及其对细胞迁移能力的影响。方法利用脂质体将真核载体pDS-RED-C1-beclin-1转染进入BT-549细胞作为实验组,空白组细胞和转染pDS-RED-C1空质粒的细胞分别作为空白对照组和阴性对照组,用RT-PCR检测转染后beclin-1mRNA表达,Western blot检测转染后蛋白表达。在正常及低氧环境下分别培养后用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测细胞增殖率,吖啶橙染色后用荧光显微镜观察细胞自噬情况,流式细胞仪检测细胞凋亡百分比。通过细胞划痕试验研究转染beclin-1基因对细胞迁移能力的影响。RT-PCR和Western blot结果及MTT所测增殖率结果用单因素方差分析,自噬和凋亡的差异采用卡方检验分析。结果 beclin-1基因被成功转染进细胞;转染后目的基因组beclin-1mRNA和蛋白表达均高于对照组,72h最明显。MTT测定结果:正常与低氧环境下实验组48h和72h增殖率均低于对照组(48hP_1=0.002,P_2=0.000;72hP_1=0.006,P_2=0.001;P_1和P_2分别为正常与低氧环境下统计结果),beclin-1与低氧刺激有明显交互作用(P=0.016),即二者能增强彼此对细胞增殖率的抑制作用。吖啶橙染色镜下观察正常和低氧环境下实验组自噬发生率明显高于空白对照组(P_1=0.004,P_2=0.001),阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义(P>0.050)。流式细胞仪检测正常和低氧环境下实验组凋亡发生率均高于空白对照组(P_1=0.045,P_2=0.008)。体外划痕试验发现转染beclin-1后细胞迁移能力降低。结论在正常和低氧环境下,转染beclin-1基因可抑制TNBC细胞BT-549增殖,促进细胞发生自噬及凋亡,并且降低其迁移能力。

乳腺癌组织Beclin1和EMT相关分子标志物表达及其临床意义探讨

目的探讨乳腺癌组织Beclin1和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关分子标志物(E-cadherin,N-cadherin)表达及其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、免疫组织化学和蛋白质印迹法分别检测2012-12-01—2013-06-01南方医科大学珠江医院收治的67例乳腺癌和正常乳腺组织标本中Beclin1及E-cadherin、N-cadherin的mRNA和蛋白表达情况,分析Beclin1与EMT及临床病理学特征的关系。结果乳腺癌组织和正常乳腺组织中Beclin1mRNA的表达量分别为2.194±0.502和5.637±1.445,z=-6.806,P<0.001;E-cadherin mRNA的表达量分别为2.647±0.717和6.538±2.045,z=-5.088,P=0.009;N-cadherin mRNA的表达量分别为6.501±0.741和3.860±0.955,z=5.928,P<0.001。Beclin1蛋白定位于胞膜和胞质,以胞质为主;E-cadherin蛋白定位于胞膜和胞质,以胞膜为主;N-cadherin蛋白定位于胞膜和胞质,以胞质为主。乳腺癌组织和正常乳腺组织中Beclin1蛋白表达量分别为5.531±0.848和7.871±0.817,z=-5.431,P<0.001;E-cadherin蛋白的表达量分别为1.257±0.142和2.885±0.294,z=-4.904,P<0.001;N-cadherin蛋白表达量分别为0.802±0.072和0.419±0.049,z=4.453,P<0.001。Beclin1蛋白是EMT的保护因素,Beclin1蛋白与人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factor 2,HER-2)、Ki-67和TNM分期呈负相关性,P值均<0.05;与年龄、组织分级、雌激素受体(estrogen receptor,ER)和孕激素受体(progestrone receptor,PR)无相关关系。结论无论mRNA水平还是蛋白质水平,乳腺癌组织中Beclin1和E-cadherin较正常乳腺组织表达均下调,N-cadherin较正常乳腺组织表达上调。Beclin1是EMT的保护因素,Beclin1与HER-2、Ki-67和TNM分期均存在负相关关系,可作为乳腺癌的预后指标,对进一步研究乳腺癌的远处转移机制提供理论参考。

beclin 1过表达对三阴性乳腺癌BT-549细胞生长抑制作用观察

目的:观察自噬调控基因beclin 1过表达对三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)BT-549细胞的体外生长影响。方法:应用荧光显微镜观察细胞转染效率,采用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测细胞beclin 1mRNA和蛋白表达水平,采用吖啶橙染色观察细胞自噬情况,采用MTT检测细胞的增殖率,采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期情况。结果:细胞转染48h实验组和对照组的细胞转染效率均>45%,qRT-PCR提示实验组细胞beclin 1mRNA 2-ΔΔCt值为16.806±2.920,较空白组(0.853±0.025)显著升高,F=88.733,P<0.001;蛋白质印迹法提示实验组细胞beclin 1/GAPDH灰度值比为1.050±0.056,较空白组(0.640±0.006)显著升高,F=137.213,P<0.001;吖啶橙染色提示实验组细胞发生自噬的比例为33%,显著高于空白组(15%),χ2=8.985,P=0.011;MTT法提示实验组细胞增殖率在24h(0.152±0.019)、48h(0.254±0.029)、72h(0.322±0.027)和96h(0.357±0.035)均显著低于空白组24h(0.202±0.023)、48h(0.308±0.030)、72h(0.446±0.032)和96h(0.851±0.014),P值均<0.05;72h实验组细胞凋亡率为(6.560±0.593)%,显著高于空白组(2.533±0.216)%,F=107.085,P<0.001;实验组G0/G1期为(63.267±3.650)%,显著高于空白组(51.533±5.152)%,F=6.566,P=0.027。结论:自噬调节基因beclin 1过表达可显著抑制BT-549细胞的体外增殖水平。