珠海市2007-2008年乙型流感病毒基因特性分析

目的了解珠海市近两年乙型流感病毒的基因变异情况。方法采集珠海市流感样病例样本进行流感病毒的分离和鉴定,并对分离到的乙型流感病毒进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增病毒基因后进行病毒血凝素HA1基因核苷酸序列测定,用Mega、DNA Star、GeneDoc软件对测序结果进行分析处理,并与WHO推荐的疫苗株基因序列进行比对。结果 2007-2008年分离的乙型流感毒株分属于Yamagata系和Victoria系两个谱系,谱系内毒株间距离很近。Yamagata系毒株与B/Brisbane/3/2007的核苷酸同源性极高,在99.4%~99.7%之间;Victoria系乙型流感病毒株与B/Malasia/2506/2004的核苷酸同源性亦很高,在98.6%~99.1%之间。与疫苗株和其它流行株相比,本次分离的两个谱系毒株均未发现核苷酸的丢失和插入,但均增加一个潜在的糖基化位点。结论珠海市人群交替流行着Yamagata系和Victoria系两个抗原性不同的进化系的乙型流感病毒,病毒的基因发生了变异。2007-2008两年WHO推荐的乙型流感疫苗株与我地区当年流行株为不同谱系毒株,预防保护效果不好。

珠海市2013年手足口病患儿柯萨奇病毒A2型分离株基因特征分析

目的分析2013年珠海市手足口病患儿柯萨奇病毒A2（CV-A2）5′UTR-VP4-VP2区基因特征,探讨其与国内外其他地区CV-A2分离株的关系。方法采集2013年珠海市手足口病患儿粪便标本,提取病毒RNA,用半巢式RT-PCR方法扩增5′UTR-VP4-VP2区,通过测序和Blast比对确定病毒型别,并利用DNAStar软件和MEGA4.1软件分别对珠海市CV-A2分离株进行核苷酸序列分析和遗传进化树分析。结果共鉴定出4株CV-A2,核苷酸序列分析表明CV-A2珠海株与2012年中国香港株在5′UTR-VP4-VP2区有最高的同源性,达97.4%~98.2%;进化树分析显示4株CV-A2珠海株与2012年中国香港株共同构成A进化树分支,Bootstrap值为99%。结论珠海市4株CV-A2与2012年中国香港株在5′UTR-VP4-VP2区具有较高的同源性,且进化关系密切。

2008年珠海肠道病毒71型分子流行病学研究

目的通过扩增VP1节段的核苷酸序列,对2008年珠海暴发流行的EV 71进行种系进化分析。方法选取10例手足口病暴发流行中的EV71阳性病例标本用一对特异引物进行VP1全基因核苷酸序列扩增,由生物技术公司在ABI3730型自动测序仪上测序,序列结果用Claxter、DNA Star、Mega软件进行分析。结果本文的10株病毒与C基因型代表株比较接近,核苷酸同源性在88.2%～99.2%之间,氨基酸同源性在98.7%～99.7%之间;尤其与C4基因型最为相近,与C4基因型相比较核苷酸同源性在97.6%～99.2%之间,氨基酸同源性在99.3%～99.7%之间;而与A、B基因型代表株比较差异较大,核苷酸同源性只在81.8%～84.4%之间,氨基酸同源性在94.6%～98.0%之间;说明本文的10株病毒皆属于EV71病毒C基因型、C4亚型。结论珠海和新会的病毒株可能与阜阳和浙江分离的EV71病毒有相同的起源,均属于C4亚型,并且C4亚型病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播,因此加强各地流行的EV71病毒基因特征分析,进而探索EV71病毒的可能进化途径,对于肠道病毒的基础研究和防范EV71在中国的大规模暴发与流行具有重要意义。

2008～2009年珠海市H3N2亚型流感病毒HA1基因特性分析

为了解20082009年珠海市H3N2亚型流感病毒HA1基因变异情况,选择珠海市20082009年期间不同时间点的经狗肾传代细胞（MDCK）培养分离的H3N2亚型流感毒株20株,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增HA1基因片段,将产物纯化并测序,推导氨基酸序列,进行基因进化特性分析。与同时期的疫苗株比较,2008年珠海市流行的H3N2亚型流感毒株HA1区抗原决定簇的氨基酸位点变异数少于4个;2009年珠海市流行的H3N2亚型流感毒株除09-0056外,HA1区存在5个位于抗原决定簇内的变异氨基酸位点。2008年H3N2亚型流感毒株的HA1区的糖基化位点与疫苗株一致;2009年H3N2亚型流感毒株HA1区丢失第144位糖基化位点。20082009年H3N2亚型流感毒株RBS氨基酸序列未见明显变异。与2008年H3N2亚型流感毒株比较,2009年H3N2亚型流感毒株HA1区抗原决定簇内存在多个位点的氨基酸替换。这些说明2008年珠海市流行的H3N2亚型流感病毒不是新变种;2009年流行的H3N2亚型流感病毒为新的变异株,这可能是H3N2亚型流感病毒在2009年6-9月为珠海地区季节性流感流行优势株的原因。

2013年广东省珠海市手足口病病原学研究

目的了解2013年珠海市手足口病病原构成和流行病学规律。方法收集2013年珠海市手足口病临床诊断病例粪便标本215份,采用荧光RT-PCR和巢式RT-PCR进行病原学检测。结果 215份病例中,183例肠道病毒阳性,其中EV71阳性45例(24.59%)、Cox A16阳性8例(4.37%)、非EV71/非Cox A16的其他肠道病毒阳性130例(71.04%)。130例其他肠道病毒阳性标本中,113例的序列测定结果 Cox A6有93例(50.82%),Cox A10有9例(4.92%),Cox A2、Cox A5、Cox A4、Cox A20、Cox A14和Echo9各有少部分病例。8个血清型与各原型株之间的遗传距离较远,但每个型别的毒株都有高度相似的国内株存在。Cox A6和EV71检出高峰分别在9月和5月;Cox A6和EV71病例间平均年龄差异有统计学意义(P<0.05);Cox A6、EV71、Cox A10和Cox A16病例间男女比例差异无统计学意义(P=0.54)。结论 2013年珠海市手足口病前4位病原体依次为Cox A6、EV71、Cox A10和Cox A16。Cox A6和EV71发病有较明显的季节性,Cox A6组的平均年龄<EV71组。

2015-2016年广东省珠海市风疹病毒分子流行病学研究

目的分析珠海市2015-2016年风疹病毒基因型别和特征,为风疹控制和消除提供分子流行病学基线数据。方法采集2015-2016年珠海市疑似风疹病例出疹后3天内的咽拭子,使用荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测风疹病毒核酸,对阳性标本进行风疹病毒E1基因739个核苷酸片段(nt8731-nt9469)的扩增、序列测定和分析,与32株13个基因型的WHO参考株、中国其他省份流行的2B基因型分别构建基因亲缘性关系树。结果2015-2016年共收集疑似风疹病例的42份咽拭子标本,其中23份病毒核酸检测阳性,经进一步扩增,18份标本获得了靶基因序列。基因亲缘性关系分析显示,18份标本均为2B基因型风疹病毒,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.2%-100%和99.1%-100%,并可分成两个进化分支,不同的进化分支包含了其他省份2B基因型分离株,无地理局限性和年代相关性。18株2B基因型风疹病毒在N-型糖基化位点、抗原表位、中和抗原决定簇和血凝抑制位点没有发生突变。结论 2015-2016年珠海市流行2B基因型风疹病毒,与全国流行趋势一致。应继续加强珠海市风疹病毒分子流行病学监测。

珠海市2011年连续发生5起乙型流感疫情的病毒HA1基因分析

目的分析珠海市2011年多起连续发生的流感疫情中分离的乙型流感毒株HA1基因特性,阐述流感暴发的原因。方法用MDCK细胞分离培养流感病毒,提取病毒核酸,采用RT-PCR扩增病毒HA基因并测定核苷酸序列,用ClustalX和MEGA4.1分析结果。结果珠海市2011年多起连续发生的流感疫情中分离的乙型流感病毒属Victoria系,与2011年流感监测分离株2011C-IN-0056-7相比,没有核苷酸的丢失和插入,没有糖基化位点的改变,核苷酸同源性在97.3%以上,氨基酸有1~3个位点发生了变异,属于同一变异株。与2010-2011年北半球乙型流感疫苗株B/Brisbane/60/2008相比较,核苷酸同源性在98.5%以上,氨基酸有1~4个位点发生变异,也属于同一变异株。结论引起本市流感连续暴发疫情的原因可能是本地流行株抗原漂移所致,与疫苗株B/Brisbane/60/2008核苷酸和氨基酸同源性都很高,吻合性较好,如果能够在儿童中普遍接种,应该能够起到很好的预防作用。

珠海市2013年肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型基因特征

目的分析2013年珠海市手足口病（Hand-foot-mouth disease,HFMD）患者中,肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）的分子流行病学特征。方法采集珠海市2013年HFMD临床诊断病例粪便标本215份,选取其中Real time RT-PCR检测EV71病毒核酸阳性的18份和Cox A16病毒核酸阳性的8份标本,进行VP4区基因扩增,并进行核苷酸序列和遗传进化关系分析。结果 16份EV71扩增测序成功,与C4a基因亚型代表株具有最高的核苷酸序列同源性（95.2%-99.5%）和氨基酸同源性（91.3%-100%）;5份Cox A16扩增测序成功,有2份与B2a亚型代表株具有最高的核苷酸序列同源性（98.6%-99.0%）和氨基酸同源性（97.1%-98.5%）,3份与B2b亚型代表株具有最高的核苷酸序列同源性（96.6%-97.1%）和氨基酸同源性（100%）。结论 2013年珠海市流行的EV71属于C4a基因亚型,Cox A16为B2a和B2b两种基因亚型。

一起由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的幼儿园食物中毒的病原学分析

目的:准确分析一起细菌性食物中毒的原因,为食物中毒处理提供依据。方法:按照GB/T4789.10-94《食品卫生微生物学检验》和WS/T80-1996《葡萄球菌食物中毒诊断标准及处理原则》方法进行检验,分析中毒的原因。结果:3家幼儿园当天饮用的乳制品均检出金葡菌肠毒素,其它食品样中未检出;患儿呕吐物中有5份分离培养出金黄色葡萄球菌,分离菌株中有2份检出金葡菌肠毒素,其中3株经同源性分析认为同一来源;2份乳品厂工人手面破损涂抹样分离出金黄色葡萄球菌,分离菌株均检出金葡菌肠毒素,2份原料罐中的生鲜奶样品中均分离出金黄色葡萄球菌,分离菌株均检出金葡菌肠毒素,所有样品均未检测出其它致病菌;菌株经不同增菌液培养后肠毒素的产生有差异,胰酪大豆肉汤产毒率最高为66.7%(6/9),脑心浸液产毒率为44.4%(4/9),普通肉汤中为11.1%(1/9)。结论:病原学结果证实本起食物中毒由饮用金葡菌肠毒素污染的乳制品引起。

2008-2009年珠海市乙型流感病毒HA1基因特性分析

目的了解珠海市2008-2009年乙型流感病毒HA1基因变异情况。方法按照采样时间,选取珠海市2008-2009年每月用狗肾传代细胞(MDCK)培养分离到的第1、2株乙型流感毒株共25株,没分离到毒株的月份不选,提取病毒RNA,RT-PCR扩增HA1基因片段,产物纯化测序,推导氨基酸序列,进行基因进化特性分析。结果 2008年珠海市乙型流感毒株在8月达到分离高峰,晚于A型流感毒株分离高峰时间7月,2009年其在4月达分离高峰,早于A型流感毒株分离高峰时间5月。2008-2009年珠海市流行的乙型流感病毒优势株为Victoria系病毒。与北半球国际疫苗株B/Florida/4/2006 like-virus(GenBank序列号CY033876.1)相比,2008-2009年珠海市流行的Yamagata系乙型流感病毒HA1片段有7个氨基酸位点发生替换:分别是103 K→R,212D→N,其中08-1267、09-0233和09-0240毒株的218N→S,08-190毒株的123P→A、245S→G、270P→S,除08-190外另5株毒株的181N→Y、245S→D,氨基酸同源性高于97%。其中有2个参与构成抗原决定簇的氨基酸位点发生替换,没有发生病毒抗原漂移。Victoria系毒株与疫苗代表株的同源性低于89%。结论 2008-2009年珠海市流行的Yamagata系乙型流感病毒与疫苗代表株同源性极高,本年度的流感疫苗株对珠海市乙型流感病毒流行的防治起了一定作用。2008-2009年珠海市流行的乙型流感病毒优势株属Victoria系,故本年度的流感疫苗株不能对珠海地区流行的乙型流感提供最佳保护。珠海市2008年乙型流感病毒流行时间较长,2009年流行高峰提前可能与此有关。

珠海市手足口病流行病学分析

目的探讨珠海市手足口病的流行病学特点。方法利用荧光PCR检测手足口病临床诊断标本和健康人群标本柯萨奇病毒A组l6型(coxsackievirus A16,CoxA16)、肠道埃可病毒71型(enterovirus 71,EV71)以及非EV71和CoxA16其他肠道病毒阳性率。采用描述性流行病学研究方法进行流行病学特征分析。结果 319份临床样本EV71、CoxA16以及非EV71和CoxA16其他肠道病毒阳性率分别为26.02%,6.90%和30.09%;180份健康人群样本EV71和CoxA16均阴性,非EV71和CoxA16其他肠道病毒阳性率2.78%。在105份手足口病实验室诊断病例中,男性68例,女性37例。1～5岁感染病例数最多,占实验室诊断病例的86.67%。病例主要集中在3～7月,占诊断总数的85.71%,高峰在6月。病例以散居婴幼儿为主。结论珠海市手足口病临床诊断病例中EV71、CoxA16以及非EV71和CoxA16其他肠道病毒阳性率显著高于健康人群。实验室诊断病例以1～5岁托幼儿童为主,男性多于女性,病例发生有明显的季节性。

食源性致病菌96微孔板DNA诊断芯片的研制

目的:建立一种能同时检测12种常见食源性致病菌的基于微孔板阵列技术的检测平台,以满足食物中毒处置中能快速、准确提供实验室结果的要求。方法:针对12种最常见的食源性致病菌,设计种特异性的PCR引物和寡核苷酸探针,按照5×5的阵列格式将探针点制到96微孔板的微孔内,建立稳定的微孔杂交体系,采用链霉亲和素碱性磷酸酶和化学显色底物NBT/BCIP来检测特异性的PCR杂交产物。结果:经标准菌株验证已建立的食源性致病菌微孔板DNA诊断芯片,获得比较敏感、特异和稳定的实验结果;同时经食物中毒样品检测应用,与传统的细菌分离培养和生化鉴定的结果相符。结论:本研究建立的能同时检测12种常见食源性致病菌的基于微孔板阵列技术的检测平台具有快速、准确、自动化和高通量等特点,作为应对食物中毒等突发公共卫生事件的实用检测技术具有重要意义。

食源性致病菌96微孔板芯片在一起食物中毒检测中的应用

目的利用微孔板芯片技术对一起食物中毒进行检测,评价其在食物中毒事件中的应用效果。方法用食源性致病菌96微孔板芯片对一起食物中毒样品进行检测,同时采用传统的病原分离方法和细菌生化鉴定仪对分离菌株进行鉴定。结果食源性致病菌96微孔板芯片对食物中毒样品的检测结果与病原分离培养结果完全一致。结论食源性致病菌96微孔板芯片具有快速、准确、自动化和高通量等特点,作为应对食物中毒等突发公共卫生事件的快速检测具有重要意义。

珠海地区副溶血性弧菌病原学特征及分子分型分析

目的研究珠海地区副溶血性弧菌血清型、毒力基因以及分子分型的病原学特征,分析流行株的分布情况。方法对珠海市2009年-2014年共81株副溶血性弧菌进行血清型鉴定及基因型耐热溶血素(tdh)、耐热直接相关溶血素(trh)和不耐热溶血素(tlh)检测,并从中选取60株进行多位点序列分析(MLST)。结果共分出35种血清型,其中优势型别为O3∶K6,占整个血清型的20.99%。所有菌株均含有tlh基因,含有tdh基因的有31株菌株,含有trh基因只有2株菌株为阳性。根据Pub MLST网络数据库提供的方法进行比对分析,60株副溶血性弧菌共分为33种ST型别。结论珠海市引起食物中毒的副溶血性弧菌主要为O3∶K6。tlh基因可以作为鉴别副溶血性弧菌的鉴定基因,多数食物中毒事件菌株中携带tdh基因。MLST的优势型别为ST3,为副溶血性弧菌其他型别共同祖先。而食品株血清型和MLST分型均呈多样化、分散趋势。

珠海市2008年H1N1亚型流感病毒血凝素HA1基因特征分析

目的了解2008年珠海地区流行的H1N1亚型流感病毒血凝素重链区HA1基因特征。方法按照时间不同选取7株2008年珠海市分离到的H1N1亚型流感毒株,选取的毒株进行血凝素HA1片段序列测定并推导出其氨基酸序列进行基因进化特性分析。结果H1N1亚型流感毒株为珠海市2008年的优势株,与该年WHO推荐疫苗株比较有多个氨基酸发生了替换,造成抗原性发生一定的变化。结论2008年根据WHO疫苗推荐株生产的疫苗对该年珠海市H1N1亚型流感预防效果并不理想,导致2008年珠海市H1N1亚型的流行强度增加。

2009年珠海市肠道病毒71型分子流行病学特征分析

目的分析2009年珠海市手足口病(HFMD)患者中,肠道病毒71型(HEV71)的分子流行病学特征。方法2009年1—10月采集珠海市各医院就诊的HFMD患者的粪便标本558份,经HEV71通用引物扩增分析,确定为HEV71阳性158份。选取其中HEV71阳性标本24份用RT-PCR扩增衣壳蛋白vp1全长基因,核苷酸序列测定并分析病毒遗传学特征。结果珠海市24例HEV71的vp1基因核苷酸序列的测定结果显示,所有核苷酸序列长度都是891bp,编码297个氨基酸。该24株HEV71全部属于C4基因亚型C4b进化分支,与C4基因型相比较核苷酸同源性在95.4%～98.9%之间,氨基酸同源性在99.3%～99.7%之间,与2008—2009年中国流行的HEV71同源性极高;但24株HEV71在vp1区的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.2%～100.0%和99.0%～100.0%,在核苷酸和氨基酸水平上存在一定差异;24例HEV71可划分为7条传播链,75%(18/24)流行株分布在其中的2条传播链,且这2条主要传播链只由珠海市HEV71分离株构成。结论2009年珠海市流行的HEV71属于C4基因亚型C4b进化分支,与中国2008—2009年流行的HEV71在基因亲缘关系和流行时间关系上都很接近,但珠海市HEV71流行株的基因特征存在其特殊性。