检测肌红蛋白的半定量金免疫层析法的研究

目的建立一种半定量检测人血清肌红蛋白的金免疫层析方法,用于急性心肌梗死的快速检测。方法一株抗人肌红蛋白单克隆抗体标记胶体金,另一株抗人肌红蛋白单克隆抗体包被膜作为检测线,兔抗鼠IgG抗体包被膜作为对照线,建立半定量金免疫层析测定方法。结果本法测定结果分为3个半定量判定区段：〈70、70-150和〉150μg/L;与化学发光免疫测定对照检测83份血清标本,符合性良好。结论金免疫层析测定法具有半定量的特点,方法简便、快速、准确,适用于急性心肌梗死的早期检测。

磁珠分离酶联免疫测定法在检测人血清肌红蛋白中的应用

目的 建立一种宽范围的定量检测人血清肌红蛋白(Mb)的磁珠分离酶联免疫测定法。方法 使用 国产聚苯乙烯磁珠,经碳化二亚胺活化表面自由羧基,得以与抗Mb单抗偶联,用此抗体包被磁珠作为固相,另 一Mb单抗标记辣根过氧化物酶,做双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人血清Mb,共检测临床血清标 本50份,并与常规板式ELISA作对比。结果 磁珠酶免疫定量检测方法用于人血清Mb定量检测范围可从常 规板式ELISA的5～200μg/L扩展到5～1000μg/L。结论 利用国产磁珠建立的磁珠分离酶免疫定量检测 Mb方法优于常规板式ELISA。

谷胱甘肽S-转移酶-肌钙蛋白I(28～110aa)表达纯化及稳定性的初步研究

目的:评估重组融合蛋白谷胱甘肽S-转移酶(GST)-肌钙蛋白I(TnI)(28～110aa)的实用价值。方法:诱导表达菌株BL21-PGEX-4T-3/TnI(84～330bp)表达GST-TnI(28～110aa),谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析柱纯化融合蛋白,经自动免疫分析仪检测其免疫反应性。采用双抗体夹心ELISA法检测稳定性,并与天然提纯心肌肌钙蛋白I(cTnI)抗原进行比较。结果:GST-TnI(28～110aa)融合蛋白表达水平高,具较高免疫反应性。在37℃条件下,GST-TnI(28～110aa)融合蛋白第3天免疫反应性仍保留60%,而人心肌提纯的cTnI在第3天免疫反应性几近丧失。结论:GST-TnI(28～110aa)融合蛋白具较高的免疫反应性,与天然cTnI相比较,重组GST-TnI融合蛋白稳定性好,有望作为cTnI测定的候选参考标准品。

肌钙蛋白T──心肌缺血损伤的新标志

肌钙蛋白Ｔ──心肌缺血损伤的新标志上海第二医科大学医学检验实验室（２０００２３）郑佐娅，陶义训肌钙蛋白Ｔ（ｔｒｏｐｏｎｉｎＴ，ＴｎＴ）是肌钙蛋白复合体（Ｔｎｃｏｍｐｌｅｘ）的一种多肽亚单位。此复合体存在于横纹肌和心肌细胞的细肌丝中，在钙离子诱导的肌肉...

抗3,4,4'-三氯联苯单克隆抗体的制备及其特性鉴定

采用含有4个碳原子臂长的PCB37半抗原衍生物合成PCB37全抗原,以人工抗原免疫BALB/C小鼠,通过鼠-鼠杂交瘤技术制备抗PCB37单克隆抗体。建立间接竞争ELISA（ic-ELISA）分析方法,对抗PCB37单克隆抗体的特性进行评估,最终获得了一株能够稳定分泌抗PCB37单克隆抗体的细胞株。使用该抗体建立了ic-ELISA,在PCB37浓度为0.10~50μg/L时,抑制率与PCB37的浓度呈线性关系,半数抑制浓度（IC50）为1.23μg/L,最低检测限（IC15）为0.027μg/L,与其他物质的交叉反应率〈5.5%。结果表明,成功研制了抗PCB37单克隆抗体,为进一步建立检测PCB37的免疫分析检测方法奠定了基础。

青霉素结合蛋白2a单克隆抗体的研制和初步应用

目的 研制青霉素结合蛋白2a（PBP2a）单克隆抗体（McAb）,为建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）免疫层析检测方法提供检测用抗体.方法 以基因工程抗原rPBP2a免疫BALb/c小鼠,通过常规小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用免疫印迹技术（Western blotting）分析单克隆抗体特异性.选取敏感、特异的单克隆抗体进行金标记和硝酸纤维膜包被,建立胶体金免疫层析检测方法.结果 共获得11株分泌抗rPBP2a的杂交瘤细胞,其中6株分泌的单克隆抗体能够与天然PBP2a呈阳性反应.用其中2株单克隆抗体建立的PBP2a胶体金免疫层析方法,可在5～ 20 min内完成检测.结论 获得了特异性针对PBP2a蛋白的单克隆抗体,并初步建立了检测PBP2a蛋白的胶体金免疫层析检测方法,为临床快速、简便检测产生PBP2a的细菌提供了检测方法.

抗rhNDPK-A单克隆抗体的制备及鉴定

目的 :研制抗rhNDPK A (recombinanthumannucleosidediphosphatekinase A)单克隆抗体 (mAb) ,并鉴定其特性。 方法 :以纯化的rhNDPK A免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备抗rhNDPK AmAb ;用免疫双扩散鉴定Ig亚类 ;West ernblot鉴定mAb的特异性 ;间接ELISA检测mAb的腹水效价、亲和常数 ,并进行表位分析。结果 :获得 6株可分泌特异性mAb的抗rhNDPK A的杂交瘤细胞系 2D9、8C7、13E2、15D9、15E3和 2 0D9,Ig亚类均为IgG1;其效价为 1× 10 -4～5× 10 -6;亲和常数为 4 .5× 10 -9～ 2 .8× 10 -10 mol/L ;共有3个抗原表位。结论 :获得抗rhNDPK A的mAb 。

氨基末端B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体的构建及纯化

目的克隆人氨基末端B型钠尿肽(NT-proBNP)基因,构建原核表达载体并纯化其表达蛋白。方法用聚合酶链反应(PCR)从正常成人cDNA库中扩增出人NT-proBNP基因,将其克隆进pUCm-T中测定核苷酸序列。构建大肠杆菌分泌性表达载体pGEX-4T-3-NT-proBNP,IPTG诱导表达,GSH-agarose亲和纯化该表达蛋白。结果经PCR扩增成功获得228bp的NT-proBNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的23%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子质量为34600。经亲和纯化后的GST-NT-proBNP的纯度可以达到95%,得率为1.7mg/100ml。结论NT-proBNP基因的克隆、表达和纯化成功,为建立NT-proBNP检测方法奠定了基础。

POCT的研究进展及应用

该文简要介绍了POCT(point of care testing,POCT)在仪器、信息化、质量管理方面的研究进展及临床应用情况。

抗人肌红蛋白单克隆抗体的制备和初步鉴定

用纯化的人肌红蛋白（Ｍｂ）抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠通过细胞杂交技术。获得１０株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株．其中３株分泌ＩｇＧ_１亚类抗体，２株为ＩｇＧ_（２ａ），５株为ＩｇＧ_（２ｂ）．间接ＥＬＩＳＡ法证明单抗腹水与Ｍｂ起特异性反应，与人血红蛋白（Ｈｂ）．人白蛋白（Ａｌｂ）无交叉反应．免疫印迹检测结果表明，６株单抗腹水能特异性识别分子量１７ＫＤ的Ｍｂ，抗Ｍｂ单克隆抗体的制备，对于急性心肌梗塞早期诊断很有应用价值．

联合检测甲胎蛋白和癌胚抗原的胶体金免疫层析试剂的研制及性能评价

目的建立一种新型的联合检测甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的胶体金免疫层析法(G ICA)。方法G4和C2为一对抗AFP单克隆抗体(M cAb),A1和C9为另一对抗CEA M cAb,G4和A1分别以直线形式平行包被于固相硝酸纤维素(NC)膜上,C2和C9分别与胶体金结合后固定于结合物垫,制备成G ICA试剂条。膜上另包被2 mg/mL兔抗鼠IgG抗体,用于检测有效性。结果利用双抗体夹心原理,建立了可同时检测血清中AFP和CEA的G ICA。本法经AFP和CEA标准液测定,试剂的敏感性为AFP 30μg/L、CEA 10μg/L,与血红蛋白、人白蛋白、人球蛋白等无交叉反应,稳定性试验表明试剂可以在室温保存6个月以上。86份经化学发光免疫分析仪定量测定AFP、CEA浓度的临床血清标本用于本法的对比测定,符合性良好。结论联合检测AFP和CEA的G ICA试剂具有结果可靠、方法简便、快速等优点,与化学发光法测定结果符合性良好。

cTnI-linker-TnC融合蛋白基因的构建、表达及鉴定

目的重组及表达人cTnI-linker-TnC融合蛋白。方法应用PCR技术从人心脏cDNA文库分别扩增出cTnI和TnC基因,通过引物设计在两者之间加上19个中性氨基酸残基TS-(G4S)3-AC的linker编码序列,克隆PCR产物,并构建pET28a-cTnI-linker-TnC表达质粒,转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白的表达,NTA树脂亲和层析纯化后检测其纯度和免疫反应性。结果成功构建了cTnI-linker-TnC融合蛋白的基因,并在大肠杆菌中实现可溶性高表达,在摇瓶中的表达量为21 mg/L,经一步NTA树脂亲和层析纯化,获得条带单一的目的蛋白,采用进口全自动免疫检测系统鉴定证实,目的蛋白有较高的免疫反应性。结论采用原核表达方法可以获得具有高纯度和高免疫反应活性的cTnI-linker-TnC融合蛋白。

尿微量白蛋白半定量金免疫层析试条的研制和临床评价

目的 建立一种半定量检测人尿液中的微量白蛋白（mAlb）的金免疫层析方法。方法 应用一株抗人白蛋白单克隆抗体与胶体金结合，组成胶体金结合物试剂；白蛋白包被在硝酸纤维素膜上，而制成竞争法的试剂条，同时用一定浓度的羊抗鼠IgG抗体作为参比线。结果 该法经人白蛋白标准液测定，结果判定可分为〈20、20-50、50-200和〉200mg／L4个半定量区段；137例经散射免疫浊度法定量测定白蛋白浓度的临床尿标本用于该法的对比测定，结果符合性良好。结论 该法具有半定量的特点，结果可靠，适用于糖尿病、高血压等并发肾病的早期诊断。方法简便、快速，特别适合中、小医院和门诊部使用。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白的低温诱导表达纯化及免疫原性的鉴定

目的探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）PBP2a的原核表达及其免疫源性的鉴定。方法根据基因文库登录的mecA基因的编码序列，设计合成了一对寡核苷酸引物，将mecA基因的70～2006bp克隆至pET28a载体，转化E．coliBL21（DE3）；经IPTG低温诱导表达后，利用镍琼脂糖凝胶亲和层析技术纯化目的蛋白；用抗PBP2a抗体鉴定纯化蛋白的免疫源性。结果成功构建了不合跨膜区的PBP2a原核表达载体，在低温诱导条件下获取的蛋白纯化后无杂蛋白；该蛋白能与商品化抗PBP2a单克隆抗体结合。结论利用分子克隆技术，获得了高纯度的不合跨膜区的PBP2a蛋白，且该蛋白具有免疫源性，为进一步制备抗PBP2a单克隆抗体奠定了基础。

纤溶酶-α_2抗纤溶酶复合物单克隆抗体的制备及鉴定

目的 :制备纤溶酶 α2 抗纤溶酶复合物 (PAP)的单克隆抗体(mAb)。方法 :以从血浆中纯化的PAP免疫BALB/c小鼠。按常规方法融合 ,以固相等分子浓度的纤溶酶原、α2 抗纤溶酶(α2 AP)及PAP为抗原 ,建立间接ELISA筛选杂交瘤细胞培养上清 ,并对杂交瘤细胞分泌的mAb的特异性和亲和力进行鉴定。结果 :共获得 2 4株可稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞。其中 ,针对PAP分子中纤溶酶结构的mAb 16株 ,针对α2 AP结构的mAb 1株 ,针对新抗原 (PAP分子中新出现的不同于前体分子纤溶酶原及α2 AP的抗原决定簇 )结构的mAb 7株。这些腹水中抗PAPmAb的滴度为 2× 10 -4～ 1× 10 -8,其中 4株mAb的亲和常数为 5 .6 2× 10 -9～ 3.5 8× 10 -11mol/L之间。结论 :成功地制备针对PAP新抗原的具有高亲和力的mAb ,为建立不受其前体分子干扰的PAP特异性检测方法 ,研究纤溶系统的激活状态提供了工具。

非小细胞肺癌患者血清血管内皮生长因子测定的临床意义

目的:监测血清血管内皮生长因子(VEGF)对评估非小细胞肺癌(NSCLC)患者预后的判断价值。方法:采用ELISA方法检测54例NSCLC患者血清VEGF的含量,分析血清VEGF水平与反映病程进展情况的TNM分期中T、N、M各参数以及患者生存期之间的关系。结果:血清VEGF水平与肺癌侵袭范围密切相关,T3鄄T4患者血清VEGF升高率明显高于T1鄄T2患者(P<0.01)。血清VEGF水平与淋巴结转移程度密切相关,N3患者血清VEGF较N1鄄N2患者明显升高(P<0.01)。有远处转移的患者中72.7%(16/22)血清VEGF升高,而无远处转移的患者血清VEGF升高仅40.6%(13/32),两者差异有显著性(P<0.05)。血清VEGF与患者生存期亦密切相关,生存≥6个月者37.5%(9/24)的患者血清VEGF升高,而生存期<6个月者66.7%(20/30)的患者血清VEGF升高,两者间差异有显著性(P<0.05)。结论:血清VEGF与NSCLC患者的病程进展及生存期相关,是一种有用的预后判断指标。

B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体构建及纯化

目的:克隆人B型钠尿肽(脑钠素,B-type natriuretic peptide,BNP)基因,纯化其表达蛋白并制备多克隆抗体。方法:用PCR技术从正常成人心脏组织cDNA库中扩增出人BNP基因,将其克隆进pUCm-T中并测定核苷酸序列。构建大肠埃希菌分泌性表达载体pGXE4T-2/BNP,用异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,GSH-agarose亲和纯化表达蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。结果:经PCR扩增成功获得96 bp的BNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的19%,用SDS-PAGE和W estern b lot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子量29 500。经亲和纯化后GST-BNP的纯度可以达到95%,500 m l菌液中得到纯化蛋白9.6 mg。多克隆抗体的效价为1∶32 000。结论:BNP基因的克隆、表达和纯化成功以及多抗的获得,为建立BNP检测方法奠定了基础。