H9N2亚型禽流感病毒和新城疫病毒混合感染环介导间接PCR鉴别方法的建立与评估

根据GenBank中禽流感病毒(AIV)的HA基因和新城疫病毒(NDV)的F基因序列保守性,分别设计2条序列相邻的特异性探针,标记于不同大小的拟南芥TOC1基因片段两端,作为报告基因,建立了AIV和NDV双重环介导间接PCR鉴别方法,AIV和NDV扩增片段大小分别为200,270 bp。结果表明,所建立的方法对AIV和NDV核酸样品可扩增出特异性目的片段,而传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡痘病毒(FPV)和鸡马立克病病毒(MDV)的核酸样品未见明显扩增;对AIV和NDV核酸样品检测的最低极限质量浓度分别为25.0,12.5μg/L;该方法特异性好、灵敏度高,2种病原同时检测不影响检测特异性和灵敏性。97份临床样本检测结果表明,环介导间接PCR对AIV和NDV的检出率分别为15.5%和27.8%,分别高于常规PCR的12.4%和23.7%,接近于SybrGreen实时PCR的15.5%和28.9%;Kappa一致性检验显示,环介导间接PCR、SybrGreen实时PCR 2种方法对AIV和NDV检测的结果高度符合,Kappa值分别为κ=0.92和κ=0.87。本试验成功建立了AIV/NDV双重环介导间接PCR检测方法,适用于临床上2种病原的快速鉴别诊断。