不同生长年限木香转录组分析及倍半萜合成基因挖掘

【目的】倍半萜是木香的主要有效成分,通过分析不同生长年限木香根部的倍半萜化合物含量及转录组差异,挖掘倍半萜合成相关基因,为深入研究木香功能基因和有效成分合成提供理论参考。【方法】10月采集同一地块中2年生和3年生健康木香植株的根部为材料,用高效液相色谱法(HPLC)测定其倍半萜化合物含量,并构建cDNA文库,利用IIllumina NovaSeq 6000高通量测序平台进行转录组测序,然后对测序原始数据进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术对基因表达结果进行验证。【结果】(1)HPLC测定结果表明倍半萜物质含量在3年生木香中更高,随生长年限延长而增加。(2)经质控筛选,转录组测序共获得40 Gb Clean base,拼接后共获得90 912条Unigenes,平均长度为1081 bp, N50为1637 bp;经与7个数据库进行比对,获得注释信息的Unigenes共有61 268条,木香与刺头朝鲜蓟(Cynara cardunculusL.)同源序列最多。(3)基于FPKM值的log_(2)倍数绝对值大于1及错误发现率小于0.05为标准筛选到827个DEGs,其中在3年生木香中有61个DEGs表达量上调,有766个DEGs表达量下调;509个DEGs被富集到109个GO项,有12项显著富集,其中分子功能3项,生物学过程4项,细胞组分5项;KEGG富集分析表明,287个DEGs被注释到178条代谢通路中,主要富集在核糖体、阿尔茨海默病、cGMP-PKG信号通路和PPAR信号通路;根据DEGs的注释信息,挖掘到7个倍半萜生物合成途径酶基因,分别为3个DXS、1个MECPS和3个GERD,这些基因在3年生木香中表达量下调。(4)进一步选择4个候选基因用qRT-PCR技术进行验证,验证结果与转录组数据一致。【结论】2年生和3年生木香的倍半萜物质含量和倍半萜生物合成基因表达存在显著差异,挖掘的倍半萜合成基因为解析木香倍半萜生物合成的分子机制和优良品种的分子育种提供基础支撑。

野生型金龙胆草核型和亲缘地理结构分析

金龙胆草Conyza blinii H.Lév.为我国云贵川地区重要的中药材,具有良好的消炎,止咳,平喘的功效。为了探究野生金龙胆草居群间的差异及其产生原因,本试验采集了9个不同地区的野生金龙胆草样本,对其进行苦蒿素含量测定、土壤无机元素含量测定、核型分析、叶绿体基因组以及亲缘地理结构分析。结果显示:在这9个居群中,攀枝花地区的野生金龙胆草次生代谢产物苦蒿素含量最高(4.8 mg/g),且该地区土壤Fe元素含量最高(5.52%)。核型分析显示金龙胆草为二倍体,染色体核型公式2n=2x=20=18m+2st。叶绿体基因组的系统进化分析表明,金龙胆草与匙叶紫菀(Aster spathulifolius Maxim.)亲缘关系较近。基于金龙胆草cpDNA的亲缘地理分析结果显示,Hap1为祖先型且金龙胆草经历过种群扩张事件,AMOVA分析显示6.2%的变异来自居群间,93.8%的变异来自居群内,居群间分化程度中等。综上,金龙胆草居群间并无显著的染色体变异,所以种群内部变异和土壤环境因素可能是金龙胆草居群间产生不同程度的苦蒿素含量差异的原因,本研究为金龙胆草野生资源的开发和利用提供理论基础。

金龙胆草中无机元素的测定和相关性分析

本研究拟建立金龙胆草中无机元素的电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)分析方法,并比较不同生境中金龙胆草元素含量。样品经微波消解后,采用ICP-AES法检测无机元素含量,并用SPSS20软件分析数据的相关性。检测了金龙胆草中的12种无机元素,并发现以下4个特征结果:①其中有害重金属Cr和Cd的含量低于检出限0.5 mg/kg,因此金龙胆草符合药用植物安全标准;②P、K、Ca、Mg和Na含量较高,Mn、Zn、Cu、Al和Fe含量较低,然而不同生境的金龙胆草中Al含量差异较大。③相关性分析显示有18对元素呈现相关性,Ca和其他元素呈负相关性,且Ca与Zn呈显著负相关;④各样品中Fe/Mn含量比值较高,证明金龙胆草是寒凉性中草药,所含无机元素在金龙胆草药效发挥的过程中起着协同作用。本研究揭示金龙胆草中无机元素与金龙胆草生理、药效的关系,从而为金龙胆草最适产地的生境指标和金龙胆草药材或饮片的质量控制及安全性评价,提供科学的参考依据。

金龙胆草组培快繁体系的建立及苦蒿素含量的测定

为建立快速高效的金龙胆草Conyza blinii H.Lév.组培快繁体系,考察不同生长时期组培样叶片中苦蒿素含量,合理利用并保护金龙胆草药材种质资源,本研究筛选野生金龙胆草幼嫩叶片为外植体,以MS和1/2 MS为基本培养基,探究组织培养各个阶段的最适培养条件。在此基础上,采用HPLC法测定不同生长时期组培样同一叶位叶片中苦蒿素的含量。结果表明,诱导愈伤组织的最适培养基配方为MS+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L,诱导不定芽的最佳培养基配方为MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L,诱导不定根的最佳培养基配方为1/2 MS+GA30.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L。炼苗后移栽的最佳基质是腐殖质和珍珠岩2:1混合。以高效液相色谱仪对不同生长时期金龙胆草组培样叶片鲜样苦蒿素含量进行分析,结果表明移栽3个月>5个月>7个月>1个月>炼苗14 d>未炼苗。本试验建立了稳定高效的金龙胆草组培快繁体系,并成功获得再生植株,为丰富金龙胆草种资质源提供了理论依据。

响应面优化绿穗苋多糖的提取工艺

本研究旨在对热水工艺提取绿穗苋多糖的条件进行优化。在单因素实验基础上,筛选得到三个主要对绿穗苋多糖提取率相关的因素,其分别为:提取料液比、提取时间和提取温度。采用响应面试验设计软件,以提取料液比、提取时间和提取温度3因素作为试验的自变量,绿穗苋多糖提取率作为因变量,运用Box-Behnken实验设计和响应面分析法,得到了热水提取绿穗苋多糖工艺的最佳条件:料液比1:42.08(g/mL),提取温度92.30℃,提取时间219.01 min有最大多糖提取率。提取率为16.68%,与试验模型预测提取率为16.81%相近。本研究对绿穗苋多糖提取优化的研究为进一步探讨绿穗苋多糖生物活性的的研究提供了材料基础。

微波法和超声波法提取绿穗苋多糖响应面优化研究

绿穗苋是一种药食兼用作物,其中多糖成份具有很高的药食价值。本研究以绿穗苋地上部分为材料,以微波和超声波两种方法对绿穗苋多糖进行提取,并通过响应面分析法对提取进行优化,确定最佳工艺,通过水提醇沉的方法得到绿穗苋粗多糖。综合比较两种提取工艺,提取效果最佳工艺为微波提取法。其条件为:提取时间41.42 min,提取功率211.65 W,料液比1:33.338 (g/mL),实际得率为13.25%。该研究结果促进绿穗苋资源的有效利用,为绿穗苋多糖的提取工艺及产品的开发利用提供理论依据。