基于Gln/GLS1/α-KG代谢轴和线粒体凋亡信号通路探讨木瓜总三萜抗D-半乳糖诱导GES-1细胞衰老的作用机制

木瓜总三萜(total triterpenoids from the fruits of Chaenomeles speciosa,TCS)是防治胃黏膜损伤的活性组分,具有潜在的抗衰老作用。然而,TCS是否改善胃衰老,尤其是对于其抗胃衰老的分子机制目前仍不清楚。基于此,该研究旨在探讨TCS对D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导人胃黏膜上皮细胞GES-1衰老的影响及作用机制,为TCS在临床上用于预防胃衰老提供科学数据。将体外培养的GES-1细胞和转染谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)过表达(overexpression GLS1,GLS1-OE)质粒的GES-1细胞用D-gal诱导衰老后,给予TCS和谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)抑制剂bis-2-(5-phenylacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide(BPTES),考察各组细胞存活率、衰老标志物β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,SA-β-gal)染色阳性细胞比例、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)和细胞凋亡的变化;采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法和比色法检测各组细胞上清液和细胞内GLS1活性、谷氨酰胺(glutamine,Gln)、谷氨酸(glutamate,Glu)、α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)、尿素和氨水平;采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞中GLS1、线粒体凋亡信号通路相关基因mRNA和蛋白表达情况。结果显示,与D-gal模型组和GLS1-OE D-gal模型组相比,TCS可显著降低D-gal诱导衰老GES-1细胞和GLS1-OE衰老GES-1细胞SA-β-gal染色阳性细胞率和MMP,抑制衰老细胞存活,促进其细胞凋亡(P<0.01),降低上清液和细胞内GLS1活性和Gln、Glu、α-KG、尿素、氨含量(P<0.01),降低线粒体中细胞色素C(cytochrome C,Cyto C)浓度以及细胞中GLS1、增殖细胞核抗原mRNA和蛋白表达(P<0.01),降低细胞中Bcl-2、Bcl-xl mRNA表达和前体半胱氨酸蛋白酶(pro-caspase)-9、pro-caspase-3蛋白表达以及Bcl-2/Bax和Bcl-xl/Bad比值(P<0.01),升高胞质中Cyto C浓度和细胞中Bax、Bad、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease activating factor 1,Apaf-1)mRNA表达及剪切型半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)-9、cleaved-caspase-3、剪切型聚ADP核糖聚合酶-1(cleaved-poly ADP ribose polymerase-1,cleaved-PARP-1)蛋白表达(P<0.01)。以上结果表明,TCS可对抗D-gal诱导GES-1细胞衰老,其作用机制与抑制Gln/GLS1/α-KG代谢轴、激活线粒体凋亡通路,进而促进衰老细胞凋亡、清除衰老细胞密切相关。

木瓜总三萜和吲哚美辛联用对弗氏完全佐剂诱导大鼠类风湿性关节炎的治疗作用研究

目的:观察木瓜总三萜和吲哚美辛联用对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用,并探寻其可能作用机制。方法:将大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、吲哚美辛5 mg/kg组、木瓜总三萜100 mg/kg组、木瓜总三萜100 mg/kg+吲哚美辛5 mg/kg联用组。除正常对照组外,各组大鼠右后脚底皮下注射弗氏完全佐剂(CFA)。14 d后,灌胃给予相应药物,1次/d,连续28 d,计算足肿胀度及关节炎指数评分。末次给药次日,取血和踝关节滑膜组织,检测血清中活性氧(ROS)、乳酸脱氢酶(LDH)和内源性抗氧化酶活性,踝关节中炎症因子含量、滑膜组织和溶酶体中组织蛋白酶B和D、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶活性及形态学分析;实时定量PCR和Western blot法检测踝关节组织中Toll样受体4/核因子κB/NOD样受体家族3(TLR4/NF-κB/NLRP3)通路相关的mRNA和蛋白表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠足肿胀度、关节炎指数评分显著增加(P<0.01),软骨破坏和炎性浸润出现,血清中ROS、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、LDH和踝关节组织中环氧酶(COX-1)、COX-2、前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-18及踝关节组织蛋白酶B、D、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶和溶酶体细胞器胞质中β-葡萄糖醛酸酶、组织蛋白酶D含量显著升高(P<0.01),血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和踝关节组织中IL-4、IL-10含量及细胞器溶酶体中组织蛋白酶D、β-葡萄糖醛酸酶活力或含量显著降低(P<0.01),踝关节组织中Tlr4、髓样分化因子(Myd88)、Nlrp3、凋亡相关的斑点样蛋白(Asc)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase1)、Cox1、Cox2、Pge2mRNA及磷酸化IκB激酶-α(p-IκBα)、磷酸化KB抑制蛋白激酶β(p-IKKβ)、硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)、细胞有丝分裂相关酶(NEK7)、NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Caspase-1、消皮素(GSDMD)、GSDMD的N端结构域(GSDMD-N)、Pro-IL-1β、Pro-IL-18、胞核中NF-κB p65蛋白表达显著上调和p-IκBα/IκBα、p-IKKβ/IKKβ比值显著增加(P<0.01),胞浆中NF-κB p65蛋白表达显著下调(P<0.01);与模型对照组比较,木瓜总三萜100 mg/kg和吲哚美辛5 mg/kg联用组大鼠足肿胀度、关节炎指数评分显著降低(P<0.01),软骨破坏和炎性浸润减少,踝关节组织中COX-1活力和mRNA表达显著上调(P<0.01),血清中ROS、LDH、氧化应激指标、踝关节组织中细胞因子、踝关节组织及溶酶体细胞器和胞质中溶酶体酶活力以及TLR4/NF-κB、NLRP3炎症小体信号通路相关的mRNA和蛋白表达被显著逆转(P<0.01)。结论:木瓜总三萜100 mg/kg和吲哚美辛5 mg/kg联用对模型大鼠有显著的治疗作用,其作用机制可能与抑制CFA诱导AA模型大鼠氧化应激和TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路激活,减轻炎症反应及纠正溶酶体功能障碍有关。