苎麻谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因的克隆及其转基因烟草特性

【目的】克隆谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因,分别构建其超量表达载体,并探讨其在转基因烟草中对氮代谢的影响。【方法】依据苎麻转录组unigenes和RT-PCR技术克隆苎麻BnGS2等位基因,利用内切酶TaqⅠ对目的等位基因在中苎1号自交F1和亲本中进行酶切鉴定,并利用生物信息学对基因序列和结构特征进行分析;通过同源重组技术分别构建BnGS2等位基因的超量表达载体,并在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404的介导下,通过叶盘法将超量表达载体转入烟草中,通过Kan筛选、转化植株基因组DNA PCR验证获得转基因T0植株;利用qRT-PCR分析BnGS2等位基因在转基因T1植株中的相对表达水平,并测定植株叶片中的GS活性、株高、鲜重、可溶蛋白及总氮含量。【结果】首次从苎麻中克隆了一对GS2等位基因,命名为BnGS2-1和BnGS2-2,等位基因序列全长1 340 bp,含有一个1 293 bp的ORF区,编码430个氨基酸残基多肽;等位基因核苷酸序列在11个位点上存在差异,导致编码的多肽在195、382位点上的氨基酸残基存在替换现象(BnGS2-1为脯氨酸和天冬酰胺,BnGS2-2为苏氨酸和丝氨酸);NCBI BLASTP分析表明苎麻BnGS2与Pisum sativum、Vigna radiata、Glycine max、Phaseolus vulgaris、Medicago truncatula具有很近的亲缘关系;构建了能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2的载体,并获得能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2转基因烟草植株;与野生型烟草植株相比,超量表达BnGS2等位基因(BnGS2-1和BnGS2-2)都能显著性提高转基因植株叶片GS活性、鲜重和可溶性蛋白的含量,株高和总氮含量也有增加,但没有达到显著性水平。另外,超量表达不同BnGS2等位基因(BnGS2-1和BnGS2-2)的转基因烟草植株,在株高、鲜重、叶片可溶性蛋白及总氮含量上并没有显著性差异。【结论】在烟草中分别超量表达来源苎麻的BnGS2等位基因(BnGS2-1或BnGS2-2)均能显著提高转基因植株的生物产量和氮利用效率,并且所克隆的2个等位基因BnGS2-1和BnGS2-2在功能上并无显著差异。

苎麻叶绿体DNA的提取及分析

以成熟中苎1号叶片为材料,采用Percoll密度梯度离心法,分离获得完整的叶绿体,并用植物基因组DNA提取试剂盒提取叶绿体DNA,经核酸和蛋白分析仪、琼脂糖电泳、核基因组及叶绿体基因组特异引物PCR检测,结果表明:所提取的苎麻叶绿体DNA纯度高,不含核基因组DNA,并适用于基因扩增等分子操作,为深入研究苎麻叶绿体基因组奠定基础。同时,本方法操作简便、快速,适用性广,为其它物种叶绿体DNA的提取提供借鉴。

苎麻胞液型谷氨酰胺合成酶基因的克隆和超量表达载体构建

谷氨酰胺合成酶是植物氮代谢途径中的关键酶,分为胞液型(GS1)和质体型(GS2)两种。本文首次从苎麻中克隆了一个胞液型谷氨酰胺合成酶基因BnGS1-1,并利用生物信息学对其序列和结构特征进行了分析。该基因序列全长1205 bp,含有一个1071 bp的ORF区,编码356个氨基酸残基的多肽,pI和Mw分别为5.64和39.19 KDa,具有beta-Grasp和catalytic两个保守功能域;蛋白序列在56、92、249和297位点分别为Asp、Cys、His和Glu。系统进化分析表明BnGS1-1与大豆(Glycine max)、四季豆(Phaseolus vulgaris)、苜蓿(Medicago sativa)、棉花(Gossypium raimondii)在同一个分支上。同时,将BnGS1-1与pBI121载体利用同源重组技术,成功构建了植物超量表达载体。因此,本研究为了解和改善苎麻饲用特性提供了物质和理论基础。

佛手挥发油抑菌活性的研究

以水蒸气蒸馏法对佛手挥发油进行提取,采用滤纸片法比较了不同提取部位挥发油抑菌作用的大小,测定了佛手果挥发油对各供试菌种的抑菌圈直径,同时就不同浓度及pH下佛手果挥发油的抑菌效果进行初步研究。结果表明:佛手果实挥发油的抑菌效果最好,佛手叶中挥发油只对酵母菌有一定的抑制作用,而枝中挥发油没有抑菌作用。用水蒸气蒸馏法提取果实挥发油得率为1.56%;佛手果实挥发油对酵母菌大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌均有较明显的抑制作用,其中对枯草杆菌的抑菌效果最强,对金黄色葡萄球菌的抑制作用相对较弱;并且挥发油具有很好的热稳定性及抑菌持久性,佛手果挥发油在100%、50%、25%三个浓度上的变化对其抑菌效果的影响明显,且在中性和偏酸性范围内抑菌效果最好。四种供试菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为:枯草杆菌1.25%、大肠杆菌1.25%、金黄色葡萄球菌2.5%、酿酒酵母2.5%。

缺氮对佛手气体交换、叶绿素荧光及叶绿体超微结构的影响

利用土培试验研究不同氮素水平对佛手叶片光合作用、叶绿素荧光参数、叶绿素含量、叶绿体超微结构及抗氧化酶活性的影响.结果表明,缺氮降低叶绿素(Chl)含量、叶绿素a(Chla)含量以及Chla/叶绿素b(Chlb),同时增加类胡萝卜素(Car)/Chl值;缺氮条件下,佛手叶片气体交换率、PSⅡ的最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)、光化学猝灭系数(qP)、PSII的电子传递效率(ETR)呈下降趋势,初始荧光(Fo)以及非光化学猝灭系数(qN)则随氮缺乏程度的加剧而升高;同时,缺氮导致超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶活性降低,膜脂过氧化程度加重,叶绿体类囊体片层结构损伤等.可见,缺氮主要是通过减少光合色素含量,降低光合电子传递速率,引起细胞的膜脂过氧化程度加剧,进而损伤叶绿体类囊体结构及光合反应中心,导致光合速率降低.

解脲脲支原体多带抗原基因分型鉴定及其临床应用研究

目的应用PCR技术对解脲脲支原体(Uu)多带抗原进行分型鉴定,探讨Uu各种基因型与临床病原学之间的关系。方法根据解脲脲支原体多带抗原基因(MBA)与16S rRNA基因和尿素酶基因结构设计10对引物,采用PCR基因扩增技术,对384例非淋菌性尿道炎和其他泌尿生殖道感染患者的临床标本,进行解脲脲支原体生物变种和基因型分型鉴定,并与Uu培养法作比较。结果384例性病门诊患者临床标本中,检测Uu培养阳性218例,阳性率56.8%;PCR基因扩增检测Uu-DNA阳性208例,总阳性率为54.2%:其中生物变种1(biovar 1)143例,占37.2%,生物变种2(biovar 2)65例,占16.9%;基因分型结果:生物变种1血清变种1(serovar 1)50例,占13.0%,血清变种3/14(serovars 3/14)64例,占16.7%,血清变种6(serovar 6)29例,占7.6%;生物变种2亚型1(subtype 1)25例,占6.5%,亚型2(subtype 2)30例,占7.8%,亚型3(subtype 3)10例,占2.6%。结论Uu是性病的重要病原体,MBA多带抗原PCR基因分型鉴定具有简便、快速、敏感、特异之优点。

短暂低温对佛手光合生理的影响

佛手(Citrus medicavar.sarcodactylisSwingle)是一种对冷胁迫较为敏感的观果植物,在生产中普遍存在着冷害影响植物生长的现象。通过模拟浙中地区冬季设施种植中常见的短暂低温弱光条件,研究了佛手叶片的光合生理变化。研究表明,15℃低温即显著降低佛手光合速率、气孔导度,显著提高胞间CO2浓度;引起Fv/Fm显著性下降及初始荧光Fo显著上升的拐点温度为10℃,但延长处理时间至72h情况下,15℃亦显著降低Fv/Fm;低温处理还降低佛手光合羧化效率、最大光合速率,并导致光抑制现象发生时对应光强降低;低温条件下佛手叶片质膜透性及MDA含量高于对照,SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性则呈下降趋势;由此可见,短暂低温弱光胁迫首先是降低核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)等碳固定关键酶活性,引起氧自由基积聚,进而引发光抑制及光合速率的下降。

苎麻自交纯合进度研究

目的研究苎麻自交后代群体的遗传多样性和群体结构,探究自交纯合进度,对自交后代群体的纯合趋势进行判断。方法以中苎1号为材料,采用筛选出的多态性高的31对SSR引物和48对SRAP引物对3个自交后代群体的基因组DNA进行扩增。通过DNA位点纯合率和遗传多样性参数分析群体的遗传多样性。用Structure、NTSYS和AMOVA软件对群体结构进行分析。并用标记指数来比较SSR和SRAP标记方法的标记效率。结果 SSR和SRAP标记得到的多样性指标变化明显,从S3代到S5代,平均扩增出57条和157条多态性条带,DNA位点纯合率上升了5.2%和4.61%,多态性位点减少了13个和44个,有效等位基因数降低了0.7883个和2.1629个,基因多样性下降了0.1143和0.0684,多样性指数降低了0.0465和0.1207。用Structure软件对群体结构分析表明S5代群体中蓝色组分最多,均在65%以上。主成分分析表明,S3群体的分散程度最高,S4和S5群体比较集中,而且S3群体包含了S4和S5群体的大部分。2种标记方法得到的群体结构和主成分分析表明,经过连续自交,后代群体的一致性越来越好。用AMOVA软件对群体内和群体间的分子变异情况分析表明2种标记方法都显示群体内变异(94.69%和99.02%)明显大于群体间变异(5.31%和0.98%),均达到整体变异的94%以上。SSR标记得到的位点平均信息量(Hav=0.4689)高于SRAP的估计值(Hav=0.4197),而平均有效复合指数(EMR=3.2781)SRAP标记大于SSR标记(EMR=1.8562),标记效率值SRAP标记(MI=1.3758)大于SSR标记(MI=0.8704)。结论 SSR和SRAP两种分子标记适于苎麻资源的遗传多样性和群体结构分析。随着自交代数的增多,后代群体的一致性不断提高,杂合度逐渐降低。

β地中海贫血一个特殊基因突变的家系分析

目的:对一个国人罕见的重型地中海贫血基因突变[CD41/42(-TCTT)·-90(C→T)]及其父母进行基因分析。方法:采用PCR/ASO探针杂交法检测中国人常见17种β-地贫基因突变,β-珠蛋白基因全长DNA克隆测序技术分析其突变基因型。结果:发现先证者父亲携带中国人常见基因突变CD41/42(-TCTT),母亲则为中国少见地中海贫血基因突变-90(C→T),而先证者则为密码子CD41/42(-TCTT)缺失突变复合-90(C→T)转录子突变。结论:-90 (C→T)在我国目前仅发现1例家系突变。

“中苎1号”和“中苎2号”苎麻营养价值的初步评价

本研究的目的是对"中苎1号"和"中苎2号"苎麻的营养价值进行初步评价,为苎麻作牧草利用提供参考。试验结果表明,苎麻的营养品质优于黑麦草和象草,和苜蓿相近;80cm收割高度下苎麻的叶、茎粗蛋白含量和叶茎比均显著高于100cm和120cm(P<0.05)的收割高度,叶、茎粗纤维含量则显著低于100cm和120cm(P<0.05),同时干物质产量和粗蛋白产量均显著高于60cm(P<0.05),生长时间相对100cm和120cm分别缩短了8d和13d。此外,"中苎1号"在80cm收割高度下的粗蛋白日增产速率显著高于其他收割高度(P<0.05)。综上可知,"中苎1号"和"中苎2号"可以做牧草开发利用。综合考虑干物质产量、营养品质、生产时间及成本,"中苎1号"和"中苎2号"在"二麻"高温期间整株收获作为反刍动物的饲草开发利用时,80cm左右是最佳的收割高度。

广东地区非小细胞肺癌EGFR基因的突变研究

目的探讨广东地区非小细胞肺癌(NSCLC)患者中EGFR基因的突变情况。方法用微分离富集肿瘤细胞,采用QIAGENDNA提取试剂盒提取基因组DNA,通过PCR扩增及DNA测序技术分析非小细胞肺癌患者中EGFR基因突变情况。结果 43例非小细胞肺癌中,有22例(51.2%)存在EGFR基因的突变,其中13例为外显子19的突变,突变类型以delE746-A750为主;6例为外显子21的突变,突变类型以L858R为主。另外,检测到2例外显子19和21的共突变和1例外显子19和20的共突变。在腺癌患者中的突变率为70.4%(19/27)高于非腺癌患者(18.8%),两者之间的差异具有统计学意义(P=0.010,﹤0.05);女性患者的突变率为78.6%(11/14)高于男性患者(37.9%),两者之间的差异具有统计学意义(P=0.012,<0.05)。同时,未发现EGFR基因的突变与肿瘤是否转移和其分化程度之间的相关性。结论在广东NSCLC中,EGFR基因的突变以外显子19的缺失突变为主,突变率以腺癌和女性较高。

基于TRV病毒的工业大麻(Cannabis sativa L.)VIGS体系的优化

病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术是一种可以通过感染病毒抑制植物内源基因表达的方法,对于验证植物基因的功能非常重要。在工业大麻中,由于其遗传体系尚不稳定,构建和优化工业大麻VIGS体系对于验证部分基因功能具有重要的意义。研究以工业大麻八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturase gene,PDS)作为报告基因,利用烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)作为载体,注射到工业大麻叶片后观察沉默效果,并对工业大麻VIGS体系进行优化,考察不同侵染方式、侵染的苗龄、目的基因片段、工作液浓度以及农杆菌菌株对沉默效率的影响。结果表明,在1周龄时采用叶背注射法,侵染菌液浓度为OD_(600)=1.0,选择GV3101作为农杆菌菌株,使用PDS片段为960~1259 bp或126~425 bp,侵染后在24℃条件下培养2~3周,可以观察到明显的沉默效果。该结果为进一步研究工业大麻的基因功能及后续的遗传改良和品种改良提供了重要的基础。同时,优化的工业大麻VIGS体系也为其他植物的VIGS研究提供了参考和借鉴。

中苎2号苎麻自交S1代遗传多样性的SSR标记分析

研究苎麻遗传多样性和遗传结构,对育种工作的深入开展和苎麻种质资源的合理保存与利用提供理论依据;本文利用SSR分子标记对新品种"中苎2号"自交后代98个单株进行遗传多样性的研究;结果表明:29对具有多态性位点的SSR引物共扩增出69条条带,多态性条带占总条带的62.3%。每对引物扩增出的条带数为1～5条,平均为2.38条,片段大小介于100bp～600bp。PopGene软件分析得Shannon多样性指数(I)为0.5444。观察杂合度为0.4103,预期杂合度为0.3695。98个单株间遗传相似系数,最小为0.76,最大为0.97。不同遗传多样性指标参数随样本量变化的趋势差别很大。样本量为60是中苎2号自交后代群体遗传多样性水平的合理取样样本。中苎2号自交S1代的倾亲遗传性很高,自交后代的分离变异程度不大。

中国主要苎麻品种遗传多样性的SSR标记分析

从76对SSR引物中筛选出29对多态引物,对我国9个主要苎麻品种进行了遗传多样性研究。结果表明:共检测到152个位点,其中多态性位点为127,占总扩增位点的83.55%,每对引物检测到2～11个位点,平均为4.38个,片段大小介于100～600bp;Popgene分析显示Nei基因多样性为0.337 1,Shannon信息指数为0.507 1;聚类分析结果显示9个苎麻品种的遗传相似系数为0.58～0.78,在遗传相似系数为0.62处可将全部材料分为A、B、C三大类,聚类分析结果与系谱来源有较好的一致性。

大盘山自然保护区白术种质资源遗传特征研究

目的研究大盘山自然保护区内不同品系白术之间的形态学特征、遗传多样性基础,为保护和选育优质种质资源奠定基础。方法对11个品系的白术样品进行了形态学、生理学比较分析,并利用ISSR分子标记技术分析其遗传多样性,通过UPCMA法进行聚类分析。结果 11份白术样品在叶片形状、叶色、根茎形态、产量、抗病性方面存在很大的差异,且这些差异并没有一定的相关性;各品系白术的光合速率也存在显著的差异,且产量和光合速率间高度相关。筛选出的15条ISSR引物共检测得到129个位点,其中107个为多态性位点,占82.95%,聚类分析表明白术各品系之间都发生了一定程度的分化现象,个别品系之间遗传分化现象严重。结论大盘山白术资源丰富,各品系间具有一定遗传差异基础,为选育优质白术资源提供基础。

低温胁迫下佛手半致死温度测定和抗寒性分析

以‘青皮’和‘矮化’佛手(Citrus medicavar.sarcodactylisSwingle)为试材,测定不同低温处理24h后叶片的电解质外渗率(REC),计算半致死温度(LT50);在半致死温度下设置不同处理时间,测定REC、超氧化歧化酶(SOD)活性、游离脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量,进行抗寒性分析。结果表明:佛手REC随温度降低及处理时间延长呈"S"型上升,LT50在-4^-5℃之间;在LT50下,随着处理时间的延长SOD活性呈先上升后下降的趋势,Pro和MDA含量逐渐上升;12~24h为佛手在LT50下冷害发生的临界时间。