抗人降钙素原特异性单克隆抗体的制备鉴定及初步应用

目的获得抗人降钙素原(procalcitonin,PCT)单克隆抗体,并鉴定其基本特性。方法从NCBI数据库中获得PCT编码序列,以原核表达系统表达PCT重组蛋白,经镍亲和层析柱纯化,获得筛选单克隆抗体的筛选原;综合应用多种生物信息学分析软件预测PCT中潜在的B细胞表位肽,用合成肽对BALB/c小鼠进行免疫,纯化单克隆抗体,通过间接ELISA、Western blot和免疫组化鉴定获得的单克隆抗体。将获得的单克隆抗体作为捕获抗体,经过配对建立检测重组PCT的ELISA体系,并初步对临床血清进行了检测。结果成功获得3株PCT特异性单克隆抗体,分别为2-D7、2-H12和4-H12,亚类分别为IgG1和IgG2a,最高效价为1∶1 024 000,亲和力最高可达到1.3×109L/mol;选取2-D7经Western blot鉴定能够检测重组PCT蛋白,经免疫组化证实能特异性识别甲状腺组织中PCT蛋白,经过配对成功建立了检测重组PCT的ELISA体系,运用建立体系检测临床血清PCT含量时发现正常组与细菌培养阳性组之间具有显著差异。结论成功表达了人PCT重组蛋白,获得了3株高特异性和高亲和力的PCT单克隆抗体,成功建立了检测重组PCT的ELISA体系,并初步用于临床样本检测。

抗人NGAL单克隆抗体的制备及其定量检测方法的建立

目的获得抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)特异性单克隆抗体并建立双抗体夹心ELISA免疫定量检测方法。方法通过杂交瘤技术制备了抗人NGAL高亲和力高特异性单克隆抗体,筛选能够结合天然NGAL的单克隆抗体并建立双抗体夹心ELISA系统。以重组人NGAL为检测对象,对系统线性范围、灵敏度、精密度和准确度(回收试验)进行全面分析和评价。通过对肾病患病组和对照组尿液标本检测初步研究其在临床上的分析性能。结果获得了8株能稳定分泌抗人NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,筛选得到F2和G2两株单克隆抗体可用于双抗夹心ELISA免疫检测。本方法线性范围为0～40 ng/ml,灵敏度为4.8 ng/ml,批内变异CV≤10.04%,批间变异CV≤9.76%,平均回收率为101.9%。临床标本检测显示肾病组与对照组有显著差异(P<0.01)。结论本研究制备了高亲和力特异性单克隆抗体并建立了双抗体夹心ELISA方法,该方法灵敏度、精密度和准确性良好,能够检测体液标本中的天然NGAL蛋白,检测结果与临床基本符合,为其临床应用和推广奠定了基础。

维生素E和β-胡萝卜素对小鼠辐射损伤的联合作用

目的:观察维生素E和/或β-胡萝卜素对小鼠经^(60)Coγ射线辐射后的抗氧化损伤作用,为维生素应用于抗辐射损伤提供实验资料。方法:昆明种小鼠随机分为阴性对照组、辐照组(阳性对照组)、维生素E组(VE组)、β-胡萝卜素组(β-car组)以及维生素E+β-胡萝卜素组(V_E+β-car组),共5组。实验小鼠除阴性对照组外,其余各组均一次性给予4.5Gy的^(60)Coγ射线照射,照射后各组灌胃给受试物,V_E的剂量为30mg/(kg·d)、β-胡萝卜素剂量为20mg/(kg·d),溶剂为经乙醇及高温处理过的市售菜籽油,对照组给予等体积的纯溶剂,连续灌胃3 d。其后摘眼球取血,处死小鼠并剖取肝脏。用酶联免疫法(ELISA)测定血清中视黄醇结合蛋白(RBP)水平,荧光法测定血清和肝脏的丙二醛(MDA)及还原型谷胱甘肽(GSH)含量。结果:与阴性对照组比较,辐射组RBP显著降低,血清和肝脏中的MDA水平显著升高、GSH水平显著降低(P均<0.05)。给予V_E和/或β-胡萝卜素使^(60)Coγ射线辐射引起的RBP下降得以回升,对血清和肝脏MDA的升高和GSH的下降均有一定的抑制作用。而V_E单用组较V_E与β-胡萝卜素联合组的作用效果更显著(P<0.05)。结论:V_E和β-胡萝卜素对^(60)Coγ射线辐射导致的脂质过氧化均有一定的抗氧化效果,但两者合用具有一定的拮抗作用。