eha,迟缓爱德华菌一个毒力调控基因

目的探讨迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)溶血相关基因(E.tardahaemolysin activator gene,eha)基因调控该菌毒力基因的作用。方法利用自杀质粒pHM5,缺失E.tarda的eha基因,得到△eha缺失菌株,再构建△eha株的互补菌株。通过平板溶血性法、接触溶血法、上清溶血法,观察野生株、△eha缺失株与及互补株溶血性的差异。利用MTT法比较三种细菌培养物的过滤液对Vero细胞的毒性的差别。利用H2O2抗性纸片扩散法,比较三种菌对过氧化氢抵抗力的差异。利用RT-PCR和SDD-PAGE电泳超速酸化离心法提取的鞭毛蛋白,比较三种细菌鞭毛基因的转录和表达的差异。结果△eha缺失株和互补株不溶血,而野生株溶血。eha基因的缺失降低E.tarda菌对过氧化氢的抵抗力,△eha缺失株较野生株的细胞毒性明显减弱,eha基因可以调控迟缓爱德菌鞭毛基因的转录和表达。结论 eha基因可以调控迟缓爱德华菌毒力基因的表达,是一个毒力调控基因。

132株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的临床分布及耐药性变迁分析

目的：了解本院临床标本中分离出的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的科室分布及耐药性变迁情况。方法：收集本院2009年1月-2011年1月共3年间临床分离到的MRSA，统计分析MRSA的分布及药敏试验结果。结果：3年内共分离出金黄色葡萄球菌（SA）249株，其中MRSA132株。分离出SA的标本中以呼吸道标本为主，占51．5％，其次为分泌物和脓液。检出率较高的科室是外科，占36．9％，其次为呼吸内科和老年科。除万古霉素、利福平、复方新诺明及呋喃妥因外，MRSA对其余的抗茵药物的耐药率均高于MSSA（对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌），耐药率均保持在40％以上，而且耐药率呈逐年上升趋势。结论：MRSA对大部分抗菌药物仍维持较高的耐药率，应定期监测临床标本中分离的MRSA耐药率，合理使用抗茵药物，延缓临床株耐药性的增长，控制医院感染的发生及暴发流行。

eha基因调控迟缓爱德华菌抵抗巨噬细胞氧化杀菌作用

目的迟缓爱德华菌(E.tarda)能够在巨噬细胞内生存和繁殖,必须抵抗细胞产生活性氧的杀菌作用。eha基因是该菌一个重要的转录调控基因,本研究探讨eha基因调控E.tarda抵抗巨噬细胞氧化杀菌的机制。方法光镜观察野生株和缺失株分别感染RAW264.7巨噬细胞的过程,及菌落计数法测定细菌胞内存活数目;测定细菌在不同H2O2浓度中的存活率;流式法检测细菌感染巨噬细胞后产生活性氧的细胞比率;qRT-PCR测定细菌超氧化物歧化酶基因sodC和过氧化氢酶基因katB的转录水平。结果 eha基因的缺失,使E.tarda在巨噬细胞内的繁殖速率明显下降(P<0.05),使该菌在不同H2O2浓度中的存活率显著降低(P<0.05),使该菌感染细胞组产生活性氧的细胞比率升高;qRT-PCR结果显示,eha基因的缺失使得该菌的超氧化物歧化酶基因sodC和过氧化氢酶基因katB转录水平下降。结论 eha基因通过调控E.tarda菌分解H2O2相关基因的表达,从而影响该菌分解巨噬细胞中活性氧的能力和在胞内外的存活率。因此,eha基因调控了E.tarda菌抵抗巨噬细胞内氧化杀菌作用,有助于该菌在巨噬细胞内生存和繁殖。

土龙祛疣洗剂对尖锐湿疣皮损内cFLIP-TRAIL凋亡通路影响的研究

目的:探讨土龙祛疣洗剂对尖锐湿疣患者皮损内c FLIP-TRAIL凋亡通路的影响。方法:将57例尖锐湿疣患者随机分为治疗组29例和对照组28例;治疗组予土龙祛疣洗剂治疗,对照组予液氮冷冻治疗,治疗6周后观察疗效及复发情况。收集皮损标本,分别采用原位杂交法、免疫组化法检测皮损内HPV病毒感染亚型及c FLIP-TRAIL和CXCL10/IP10蛋白的表达。结果:两组临床疗效比较,差异无统计学意义(P>0.05),治疗组复发率低于对照组。治疗组患者治疗后皮损中c FLIP-TRAIL明显上调(P<0.05),可能与CA预后密切相关;治疗组患者治疗前后表皮Bax、Bcl-2蛋白变化不明显(P>0.05);患者皮损中CXCL10/IP10与c FLIP-TRAIL指数呈显著正相关(r=0.7715,P<0.05;r=0.8088,P<0.05)。结论:土龙祛疣洗剂可能通过上调c FLIP-TRAIL的表达、增强CXCL10/IP10活性来发挥抗病毒的治疗作用。

土龙祛疣洗剂对尖锐湿疣皮损microRNA表达的影响

目的:探讨土龙祛疣洗剂对尖锐湿疣(CA)皮损标本中micro RNA分子表达谱的影响。方法:以39例CA患者为观察组,使用土龙祛疣洗剂熏洗治疗,6周后观察疗效。以同期自本院外科就诊的10例行包皮环切患者为对照组,取其正常包皮组织。采用q RT-PCR检测2组5个炎症相关micro RNA(mi R-21、mi R-203、mi R-125b、mi R-146a和mi R-155)的表达情况。结果:39例CA患者治疗6周后27例皮损消退明显,症状减轻,总有效率为69.2%;观察组mi R-203与正常对照组相比呈现低表达,土龙祛疣洗剂治疗后呈现明显上调,差异有统计学意义(P<0.01);mi R-21治疗后表达量与治疗前相比则下调明显(P<0.05);而mi R-155、mi R-125b、mi R-146a分子在治疗前后无明显变化。结论:土龙祛疣洗剂治疗尖锐湿疣疗效肯定,可能通过下调mi R-21和上调mi R-203分子来发挥抗病毒的治疗作用。

基于RNA-seq分析Eha调控迟缓爱德华菌抵抗酸化的作用

目的 Eha是一个影响迟缓爱德华菌(Et)胞内生存的转录调控因子,本研究有助于揭示其调控Et抵御酸的分子机制。方法用ATPase抑制剂洛霉素A1抑制巨噬细胞的酸化,菌落计数法比较酸化对野生株和eha基因缺失株胞内存活数目的影响;比较两种细菌在酸性应激实验中存活率的差异;构建pMP220-P_(eha)LacZ质粒,采用β-半乳糖苷酶实验检测eha基因的启动子在不同酸性pH值下和不同培养时间的转录活性;选择Eha转录水平最高的一个酸性pH值和培养时间,分别提取两种细菌RNA,进行RNA-Sequencing;并用qRT-PCR验证其结果。结果野生株ET13在巨噬细胞内和不同pH酸环境中的存活率明显高于缺失株,阻止酸化胞内菌数明显高于未阻止酸化的胞内菌数(P<0.05)。对数期细菌pH6.3培养基生长2h,RNA-Sequencing结果表明:eha基因缺失株转录水平和野生株相比,147个差异显著表达的基因(DEGs)(|log2Ratio|≥1),其中113个上调,34个基因下调,qRT-PCR随机抽样,和RNA-Sequencing表达趋势呈强相关。147个基因采用GO数据库进行功能聚类,分成25类,主要涉及细菌加工、定位、代谢、结合、催化、运输、细胞成份;基于KEGG通路的富集分析,有130个可以富集到55条通路中,包括与氨基酸、核苷酸、脂质代谢及铁的转运等路径,涉及基因较多的有双组分系统、ABC转运系统、不同环境中的微生物代谢和次级代谢产物等路径。结论在酸性生存环境,Eha对Et的转录组呈多途径、多基因的适应性的全局性调控。

eha基因对迟缓爱德华菌抵抗巨噬细胞内外压力的影响

目的 E.tarda能够在体内外许多环境包括在巨噬细胞内生存和繁殖,eha基因是该菌一个重要的转录调控基因,本研究探讨该基因在细菌抵抗巨噬细胞内外压力中的作用及机制。方法采用体外实验模拟巨噬细胞内氧化和酸杀菌条件、体内血清和胆汁杀菌条件、以及细菌对SDS和多粘菌素B敏感性试验,比较ET-13毒力株及其Δeha缺失株和ehaComp互补株在这些压力下存活率,利用RT-PCR和SDS-PAGE电泳,比较上述3种细菌相关基因的转录和表达的差异。结果eha基因的缺失使ET-13对酸、H2O2、SDS和多粘菌素B敏感性提高(P<0.05);经小鼠血清或鱼胆汁处理后,3种菌株的存活率没有明显区别(P>0.05);RT-PCR结果显示,eha基因的缺失使得E.tarda内的超氧化物歧化酶基因sodC、过氧化氢酶基因katB和鞭毛蛋白基因fliC、Ⅲ型分泌系统分泌蛋白基因eseC的转录水平下降。SDS-PAGE电泳结果显示,缺失株的主要外膜蛋白比野生株表达降低。结论 eha基因通过调控E.tarda相关基因的表达,参与了该菌抵抗巨噬细胞内氧化和酸等的压力,有助于细菌在巨噬细胞内生存和繁殖。

转录因子Eha直接调控迟缓爱德华菌的靶基因

目的 Eha是一种重要转录调控因子,它可以影响迟缓爱德华氏菌(Et)的胞内存活,本实验探究Eha直接调控的靶基因如何抵御巨噬细胞杀灭细菌的分子机制。方法构建pGEX-4T-ehaflag重组质粒,电击导入eha基因缺失株的ET-13菌,得到Cehaflag ET13重组菌;用Western blot检测重组菌Eha-Flag融合蛋白的表达,并用细菌胞内存活实验检测细菌EhaFlag融合蛋白的活性;我们釆用染色质免疫共沉淀(CHIP)技术,用抗Flag标签抗体对靶基因沉淀Eha-DNA片段,除去结合的蛋白并纯化DNA片段;以RNA-Sequencing的差异表达基因设计引物,以CHIP得到的DNA样品为模板,进行qRT-PCR; PCR扩增靶基因的启动子区域,构建了pBAD-P_靶lac Z重组质粒,电击分别导入ET-13野生株和eha基因缺失株,比较它们β-半乳糖苷酶活性的差异;SDS-PAGE电泳比较野生株和缺失株外膜蛋白、厌氧C4二羧酸转运蛋白DcuA1和鞭毛钩蛋白FlgK表达的差异,并用细菌胞内存活实验比较野生株和缺失株的差异。结果 Western blot表明,Cehaflag ET13重组菌能够表达Eha-Flag融合蛋白;细菌胞内存活实验表明,该融合蛋白完全可以恢复缺失株在胞内降低的生存能力,Flag融合标签不影响Eha蛋白的功能;通过qPCR鉴定CHIP,富集到Eha的结合靶点,最终筛选出10个Eha直接结合的基因;通过野生株和缺失株中β-半乳糖苷酶活性的差异,证明eha基因对5个靶基因启动子有直接调控作用;通过检测野生株和缺失株表型的差异,证明eha基因对靶蛋白DcuA1,TnaA和FlgK的表达和活性有调控作用。结论 Eha可以通过直接调控这些靶基因,使Et菌在巨噬细胞内的存活受到影响。

阴气虚在AIDS合并尖锐湿疣致病机制中的作用

艾滋病(AIDS)合并尖锐湿疣阳性率较高。且与不良预后(致癌)密切相关。中西医结合治疗AIDS合并尖锐湿疣的疗效肯定,其作用机制值得进一步研究。AIDS正是由于存在阴气虚的情况,所以卫气抗邪的结局总是不能清除艾滋病病毒(HIV),且容易导致其他阳毒例如人类乳头状病毒(HPV)的二重感染,机体为气虚浊留病情迁延不愈。阴气虚是AIDS合并尖锐湿疣的主要特点,中医的"消荫翳解阴毒"和"补肾生髓"疗法,应为AIDS行之有效的治疗方法。中医认为,HIV、HPV分属阴毒和阳毒,文从阴阳毒病因和分子免疫学的角度,对AIDS合并尖锐湿疣病机的现代物质基础研究进行阐述。