重组蛋白PFKFB3的表达、纯化及酶活测定

目的 研究大肠杆菌中人6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶亚型3(PFKFB3)重组蛋白的诱导表达,并对表达的重组蛋白进行纯化及酶活测定。方法 通过在感受态细胞BL21(DE3)中转入PFKFB3原核质粒,经终浓度为25μg/ml的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在16℃培养细菌过夜,表达PFKFB3重组蛋白。冰上超声破菌,离心收集蛋白,通过镍(Ni)柱亲和层析和分子筛纯化蛋白,运用焦磷酸-磷酸果糖激酶(PPi-PFK)法测定PFKFB3酶活性。结果 蛋白丰度图谱结果显示,PFKFB3蛋白经过Ni柱亲和层析和分子筛纯化后,基本只有1个PFKFB3的强吸收峰,纯化效果良好。应用考马斯亮蓝法测定PFKFB3蛋白浓度为2~4μg/μl,成功获得了较高纯度和浓度的PFKFB3重组蛋白。通过PPi-PFK酶活性分析法测得PFKFB3的果糖-6-磷酸(F-6-P)和三磷酸腺苷(ATP)位点的米氏常数(Km)值分别为142.5、34.21μmol/L。结论 人PFKFB3表达载体的成功构建以及重组蛋白纯化,为进一步进行其功能研究和抑制剂研发奠定了基础。