过敏毒素受体(C3aR)在db/db糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达及病理意义分析

利用半定量RT-PCR、免疫组化和Western blotting的方法,同时从mRNA水平和蛋白质水平对过敏毒素受体(C3aR)在不同病理阶段的2型糖尿病肾病模型小鼠——db/db小鼠肾脏中的表达情况进行了较为系统的分析.结果发现:a.在糖尿病前的db/db小鼠(4周龄的db/db小鼠),C3aR与作为正常对照的db/m小鼠相比没有明显差异.随着肥胖的加剧,高血糖、蛋白尿的发生和发展,C3aR在db/db小鼠肾脏中的表达显著升高.b.免疫组化分析显示,C3aR广泛地表达于db/m和db/db小鼠肾脏的皮质和髓质,分布于肾脏的上皮细胞中(包括肾小管上皮细胞、肾小球中的脏层上皮细胞(足细胞)和壁层上皮细胞).从部位来看,皮髓交界处的肾小管中C3aR表达量明显要比其他部位的多.在肾小球,C3aR特异地存在于足细胞部位.在db/m小鼠,不同周龄小鼠肾脏中C3aR的表达量并没有明显变化,但在db/db小鼠,从8周龄开始,分布在db/db小鼠肾小管上皮细胞和小球足细胞中的C3aR均随小鼠周龄的增加而增加,至少在时间上,与小鼠糖尿病肾病的发生发展相关,其中尤以足细胞中和皮髓交界处肾小管上皮细胞中的变化最为明显.c.在糖尿病肾病小鼠中高表达C3aR的肾小管上皮细胞常有空泡变性的情况.上述工作印证了先前对2型糖尿病肾病患者肾小球基因表达谱的分析结果,更加明确了C3aR与糖尿病肾病的相关性,同时揭示了C3aR在正常小鼠和糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达、分布和变化规律,有利于进一步揭示C3aR的功能及其在糖尿病肾病发生、发展过程中的可能作用,探讨糖尿病肾病的分子机制。

高表达C3aR的肥大细胞在糖尿病肾病患者肾组织中的分布及病理意义分析

选取糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)早期、中期、晚期以及正常移植供肾各15例,分别作为DN早期组、中期组、晚期组和正常对照组,利用各个病例的肾穿刺组织标本进行C3aR免疫组化染色,分析各组中高表达C3aR浸润细胞的数量和分布特点,及其与DN发生、发展的关系,利用连续切片、免疫荧光双套色染色、免疫电镜、及甲苯胺蓝染色等方法对DN患者肾组织中高表达C3aR的浸润细胞进行细胞类型鉴定.结果表明:a.光镜和免疫电镜的形态学分析显示DN患者肾组织中高表达C3aR的浸润细胞在形态上具有肥大细胞的特点,免疫荧光双套色染色的分析显示,C3aR浸润细胞CD45阴性、CD68和类胰蛋白酶阳性,与肥大细胞的情况一致,甲苯胺蓝特殊染色进一步证实这是一种肥大细胞.b.正常移植供肾组织中虽有肥大细胞分布,但数量很少;从DN早期组到DN中期组,再到DN晚期组,肾组织中肥大细胞的数量有一种不断增加的趋势;DN患者肾组织肥大细胞的数量与24 h尿蛋白和血肌酐水平均具有很好的线性相关性.上述工作不仅揭示了在DN发生发展过程中肥大细胞在DN患者肾组织中的数量及分布情况,提示肥大细胞很可能参与了DN的发生发展过程,同时,DN患者肾组织肥大细胞高表达过敏毒素C3a受体C3aR的发现,提示C3a/C3aR通路很可能在DN患者肥大细胞的招募和激活过程中有重要作用.

db/db小鼠糖尿病肾病相关基因的分析和克隆

用GM U74A基因芯片分别检测了正常对照组 (db/m小鼠 )、糖尿病肾病组 (db/db小鼠 )、大黄酸治疗组 (大黄酸 15 0mg/kg治疗 12周 )肾脏基因表达谱 .发现在 12 43 7个基因 (包括表达序列标签 )中 ,与正常对照组相比 ,糖尿病肾病组有 10 85个基因表达下调 ,3 7个基因表达上调 ,其中变化幅度大于 2倍 ,表达下调的有 166个和表达上调的有 2 9个 .与糖尿病肾病组相比 ,大黄酸治疗组有 3 84个基因表达下调 ,15 5个表达上调 ,其中变化幅度大于 2倍 ,表达下调的有 47个和表达上调的有 3 0个 .在此基础上 ,对其中的一个差异表达的表达序列标签 (EST)进行了详细的生物信息学分析 ,发现它是一个未知功能基因———“REKENcDNA0 610 0 0 6H10”基因的一部分 .在用RT PCR进一步验证了其与糖尿病肾病的相关性后 ,对“REKENcDNA0 610 0 0 6H10”

环境因子对青海弧菌生长和发光的影响

该文采用了多因子正交试验与单因子试验相结合的方法研究了环境因子对青海弧菌生长和发光的影响。发现各因子对青海弧菌的生长和发光的影响程度是不同的。其中甘油对生长的影响最大，而对发光的影响最大的却是氮源。根据各因子的影响情况，本文提出了有利于青海弧菌生长和发光的较好的培养基配方及培养的温度条件，并试着对环境因子对青海弧菌生长和发光的影响机制作了一些讨论。

一个糖尿病肾病相关新基因的筛选、克隆和序列分析

利用Affymetrix寡核苷酸基因表达谱芯片对 2型糖尿病肾病模型动物———db/db小鼠的肾脏基因表达谱进行了研究 .在此基础上 ,利用末端快速扩增法和RT PCR方法 ,对筛选出来的一个糖尿病肾病相关表达序列标签(EST)进行了cDNA克隆和表达分析 .得到了一长为 1 4kb的cDNA ,并暂时命名为mdnr4 1 1 (mousediabeticnephropathyrelatedmRNANo 4 1 1 ) .序列分析和网上数据库比对说明 ,这是一个新的cDNA序列 .利用DNA序列分析软件对此cDNA阅读框进行的预测性分析表明 ,此cDNA包含了一个完整的阅读框序列 .其编码的蛋白质由 90个氨基酸残基组成 .以氨基酸序列进行的同源性搜索表明 ,此多肽只与Archaeoglobusfulgidus的Na+ /H+ antiporter(napA 2 )具有局部的同源性 .以上结果表明 ,mdnr4 1 1是一个功能完全未知的小鼠糖尿病肾病相关新基因 .mdnr4 1 1cDNA的成功克隆 ,为进一步研究其生物学功能及其在糖尿病肾病发生。

肥大细胞在糖尿病肾病患者肾组织中的分布及相关性研究

目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是慢性炎症性疾病。肥大细胞是多功能的免疫细胞,具有以多种方式参与DN发生发展的潜在能力。但目前尚未见有较全面的对肥大细胞与DN关系的分析和研究报道。文中研究在DN发生发展过程中肾组织中肥大细胞数量、活化水平的变化,及探讨肥大细胞与DN发生发展的相关性及可能病理作用。方法选取DN病例80例,其中早期19例、中期32例,晚期29例。同时选取正常供肾16例作为正常对照。以类胰蛋白酶作为肥大细胞标记分子,利用免疫组化的方法分析肾穿刺组织标本中肥大细胞的数量。以CD3、CD20、CD68分别作为肾组织T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞的标记分子,利用免疫组化染色方法分析肾穿刺组织标本中上述炎症细胞数量。根据肥大细胞周围的甲苯胺蓝异染颗粒及细胞内颗粒减少情况分析肥大细胞的脱颗粒反应,据以分析肾织织肥大细胞的活化水平。以此为基础分析肾组织中肥大细胞与DN临床病理指标的相关性。结果①在正常对照和DN患者的肾组织中肥大细胞主要分布于肾小管间质,肾小球中极少发现肥大细胞。DN患者的肾组织中,还可见肥大细胞侵入肾小管壁。②正常对照肾组织肥大细胞数量很少。在DN的肾组织中,肥大细胞数量随着病情发展而显著增加。③与正常对照相比,DN患者肾组织肥大细胞发生脱颗粒的比例显著增高,且表现为随DN进展而逐渐增加的趋势。④相关性分析显示,DN患者肾组织肥大细胞数量与肾功能损伤指标、小管间质损伤指标和炎症指标具有显著相关性。结论肥大细胞参与DN的发生发展过程,可能主要通过脱颗粒作用,释放细胞内的生物活性物质。肥大细胞在DN的肾小管间质损伤中发挥重要作用。肥大细胞可望成为DN防治的新靶标。

血管生成素样蛋白2在糖尿病肾病小鼠肾组织中的表达定位

目的:血管生成素样蛋白2是近年来发现的与血管发生密切相关的新蛋白,在既往研究中已发现血管生成素样蛋白2在肾中的表达水平与糖尿病肾病的病理过程相关,但未对血管生成素样蛋白2在肾脏中的表达进行精确定位。文中分析血管生成素样蛋白2在糖尿病肾病小鼠肾小球和肾小管中的表达情况,并对其在糖尿病肾病小鼠肾脏细胞中进行准确定位。方法:利用激光微分离技术分离糖尿病肾病小鼠肾脏组织中的肾小球和肾小管,以半定量RT-PCR方法分析血管生成素样蛋2 mRNA在肾小球和肾小管中的表达情况;利用免疫组化、免疫荧光双套色染色和免疫电镜方法对血管生成素样蛋白2在肾中的表达进行准确定位。结果:半定量RT-PCR分析结果显示血管生成素样蛋白2 mRNA仅表达于肾小球,而不在肾小管表达,且db/db糖尿病肾病小鼠肾小球中的血管生成素样蛋白2 mRNA水平明显高于正常对照;免疫组化分析结果显示血管生成素样蛋白2分布位置与足细胞位置重叠;免疫荧光双套色染色观察到,血管生成素样蛋白2分布与足细胞特异性标记蛋白WT1一致;免疫电镜分析结果显示,血管生成素样蛋白2主要分布于足细胞的细胞体和足突。结论:在糖尿病肾病小鼠肾,血管生成素样蛋白2基因只在肾小球表达,足细胞是血管生成素样蛋白2的特异性产生细胞。

血管生成素样蛋白2单克隆抗体的制备和分析

目的:研制抗人血管生成素样蛋白2(ANGPTL2)单克隆抗体,为进一步进行ANGPTL2的表达分析和功能研究,揭示其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造条件。方法:以纯化的ANGPTL2重组蛋白皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择性培养基筛选,克隆和亚克隆化培养,ELISA鉴定,得到能稳定分泌抗人ANGPTL2的杂交瘤细胞;以硫酸铵沉淀法从杂交瘤细胞培养上清中初步纯化、制备抗人ANGPTL2单抗,以Western blot、细胞免疫染色和免疫组化染色相结合的方法对制备的单抗进行滴度和特异性鉴定。结果:得到1株能稳定分泌抗ANGPTL2的杂交瘤细胞,从其培养上清中制备的抗ANGPTL2单克隆抗体具有较好的特异性和较高的滴度,可用于Western blot、细胞免疫染色和免疫组化染色。结论:成功地研制了抗ANGPTL2单克隆抗体,为进一步进行ANGPTL2的表达分析和功能研究,揭示ANGPTL2的功能及其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造了条件。

C3aR——检测肾组织肥大细胞的敏感标志

目的:探讨过敏毒素受体C3aR高表达细胞在正常个体和各种肾脏病患者肾组织中的分布情况,对其细胞类型进行鉴定,并对C3aR能否作为肥大细胞特异性标记分子进行评估。方法:利用免疫组化的方法分析C3aR高表达细胞在正常供肾组织和包括2型糖尿病肾病(T2DN)、IgA肾病、急性间质性肾炎、慢性间质性肾炎、ANCA相关性血管炎、微小病变性肾病、膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)以及狼疮性肾炎在内的各种肾脏病患者肾组织中的分布情况;利用光镜、免疫电镜、免疫荧光双套色染色和甲苯胺蓝特殊染色等方法对肾组织中高表达C3aR的细胞类型进行鉴定;在此基础上,对C3aR作为肾组织肥大细胞特异性标记分子进行评估。结果:(1)C3aR高表达细胞在正常供肾组织和包括T2DN、IgA肾病、急性间质性肾炎、慢性间质性肾炎、ANCA相关性血管炎、微小病变性肾病、膜性肾病、FSGS以及狼疮性肾炎在内的各种肾脏病患者肾组织中均存在。(2)光镜和免疫电镜的形态学分析显示肾组织中高表达C3aR的浸润细胞在形态上具有肥大细胞的特点;免疫荧光双套色染色的分析显示,这种细胞CD45阴性、CD68和类胰蛋白阳性,与肥大细胞的情况一致;甲苯胺蓝特殊染色进一步证实其为肥大细胞。(3)虽然C3aR也同时表达于小管上皮细胞等其他细胞,但其在肥大细胞中的表达水平远远高于其他细胞,这种表达水平差异足以区分肥大细胞与其他细胞。(4)与目前最常用的肥大细胞标记分子——肥大细胞类胰蛋白酶相比,C3aR作为肥大细胞的标记分子具有相似的检测灵敏度和更好的特异度。结论:C3aR在肾组织肥大细胞特异性地高表达,是肾组织肥大细胞的一个敏感标记分子,完全可代替类胰蛋白酶,以免疫组化的方法检测肾组织中的肥大细胞。

血管生成素样蛋白2在糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达研究

利用半定量RT-PCR和免疫组化的方法同时从mRNA水平和蛋白质水平对血管生成素样蛋白2在不同病理阶段的2型糖尿病肾病模型小鼠——db/db小鼠肾脏中的表达情况进行了较为系统的分析.结果发现:a.在糖尿病前的db/db小鼠(4周龄的db/db小鼠),血管生成素样蛋白2与作为正常对照的db/m小鼠相比,差异不是很大,随着肥胖的加剧,高血糖、蛋白尿的出现,血管生成素样蛋白2在db/db小鼠肾脏中的表达无论从mRNA水平还是从蛋白质水平均显著升高.b.从免疫组化的分析结果来看,血管生成素样蛋白2主要分布于小鼠肾脏的肾小球部分,主要是沿毛细血管袢呈线性分布,其位置与足细胞的位置重叠,足细胞是小鼠肾脏中血管生成素样蛋白2的主要分泌细胞.c.小鼠肾脏血管生成素样蛋白2的表达水平似乎还与鼠龄相关:虽然变化幅度不是很大,但在周龄较大的小鼠(如20周龄以上),其表达水平相对较高.上述工作不仅印证了先前对2型糖尿病肾病患者肾小球基因表达谱的分析结果,更加明确了血管生成素样蛋白2与糖尿病肾病的相关性,同时揭示了血管生成素样蛋白2在正常小鼠和糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达、分布和变化规律,有利于进一步揭示血管生成素样蛋白2的功能及其在糖尿病肾病发生、发展过程中的可能作用,探讨糖尿病肾病的分子机制.

AL023001基因在2型糖尿病肾病小鼠中的差异表达分析

利用Affymetrix寡核苷酸基因表达谱芯片对 2型糖尿病肾病模型动物———db/db小鼠的肾脏基因表达谱进行了研究.在此基础上,利用末端快速扩增法和RT PCR的方法,对筛选出来的一个糖尿病肾病相关EST进行了cDNA克隆和表达分析.得到了一长为 1 7kb的cDNA片段.序列分析和网上数据库比对发现,此cDNA片段是小鼠表达序列AL0 2 30 0 1的一部分.根据AL0 2 30 0 1序列设计特异性引物,利用半定量RT PCR的方法对AL0 2 30 0 1在db/db小鼠肾脏、肝脏、脂肪、骨胳肌、脑等组织中的表达情况进行了分析,发现AL0 2 30 0 1在db/db小鼠肾脏中的表达情况与基因芯片检测结果吻合,且AL0 2 30 0 1在肝脏、脂肪、骨胳肌和脑等糖尿病肾病相关联组织中均有差异表达.这些结果提示:AL0 2 30 0 1与db/db小鼠的糖尿病肾病具有相关性.上述工作有利于揭示AL0 2 30 0 1基因的功能。

血管生成素样蛋白2纤维蛋白原样功能域多克隆抗体制备及分析

目的:克隆血管生成素样蛋白2(angiopoietin like protein2,ANGPTL2)cDNA;构建ANGPTL2纤维蛋白原样功能域原核表达载体;表达得到ANGPTL2纤维蛋白原样功能域融合蛋白;制备针对ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的多克隆抗体,为全面分析研究ANGPTL2的功能及其与糖尿病肾病微血管病变的关系创造条件。方法:利用RT-PCR方法从肾脏总RNA中扩增ANGPTL2全长cDNA;以其为模板扩增编码ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的cDNA片段,并进而将其克隆至原核表达载体pET-15b上,构建成ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的原核表达载体pET-ANGPTL2;将pET-ANGPTL2导入BL21(DE3)菌内,通过IPTG诱导表达重组蛋白;利用重组蛋白5'端带有Histag的特点,采用含Ni的树脂进行亲和吸附纯化,获取高纯度的重组蛋白;将重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗ANGPTL2多克隆抗体;利用ELISA法测定和免疫组化分析对此多抗的效价和特异性进行分析。结果:取得了带有完整阅读框的ANGPTL2全长cDNA;构建成与预先设计完全一致的原核表达载体pET-ANGPTL2;成功地在大肠杆菌中进行了ANGPTL2纤维蛋白原样功能域融合蛋白的表达,纯化获取纯度很高的重组蛋白;经免疫兔获取高效价的针对ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的多克隆抗体;ELISA检测和免疫组化分析表明,此抗体不仅具有很高的效价,而且具有很好的特异性。结论:我们成功地克隆了ANGPTL2cDNA,构建了其原核表达载体,进行了原核表达,成功取得高纯度的重组蛋白,并得到了高效价、高特异性针对ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的多克隆抗体,为全面分析研究ANGPTL2功能及其与糖尿病肾病微血管病变的关系创造条件。

CXCL16在db/db糖尿病肾病小鼠肾组织中的表达

目的:了解在糖尿病肾病(DN)发生发展过程中,CXCL16在db/db小鼠肾脏中的表达变化,并对其与DN的相关性进行初步探讨。方法:选取分别代表DN不同发展阶段的4、8、12、16和20周龄的db/db小鼠和同龄db/m小鼠各6只;取左肾的一半用于提取总RNA;右肾用于制作冰冻切片、石蜡切片、电镜标本等;利用半定量RT-PCR的方法分析各组小鼠肾脏中CXCL16 mRNA相对表达水平,以免疫组化的方法分析CXCL16蛋白在各组小鼠肾组织中的表达和分布情况;同时测定各组小鼠的体重、血糖、血三酰甘油、血胆固醇和24h尿白蛋白排泄量,分析各组小鼠的肾脏组织病理情况以了解小鼠DN的发生发展情况。结果:(1)与同龄的db/m小鼠相比,4周龄的db/db小鼠的体重有所增加,但血糖、血三酰甘油、血胆固醇、24h尿白蛋白排泄量均无明显差异,肾脏组织病理分析也无明显变化,说明4周龄的db/db小鼠尚未发生糖尿病;但8周龄的db/db小鼠的血糖、24h尿白蛋白排泄量均已有明显升高,且肾组织中也已出现肾小球肥大、系膜区扩张、基膜增厚等DN病理改变,说明8周龄的db/db小鼠已发生了DN,但从各方面的情况来看,8周龄db/db小鼠的DN仍较轻,可代表DN早期的情况;自8周龄以后,db/db小鼠的血糖、血三酰甘油、血胆固醇、尿白蛋白排泄量以及肾小球肥大、系膜区扩张、基膜增厚等情况随着鼠龄的增长而不断的增加,说明db/db小鼠的DN不断进展。(2)与同龄的db/m小鼠相比,CXCL16在4周龄的db/db小鼠肾脏中的表达并没有明显变化;但8周龄db/db小鼠肾脏中CXCL16的表达水平已有所增加。此后,随着鼠龄的增加,DN的进展,CXCL16的表达水平逐渐增加。(3)在成年正常小鼠,CXCL16主要分布于小鼠肾脏髓质的小管中,相对来说在肾脏皮质中的分布较少;在DN小鼠,分布在肾小管和小球中的CXCL16均有明显增加;且肾小球CXCL16的表达增加主要发生在足细胞的位置。(4)CXCL16在幼年小鼠(指4周龄的db/m和db/db小鼠)肾脏中的表达分布与成年小鼠(指8周龄以上)亦存在一些差异,这可能提示CXCL16与小鼠肾脏的正常生长发育有关。结论:db/db小鼠肾脏中CXCL16的表达随DN的发生发展而增高,至少在时间上与DN具有相关性,提示CXCL16可能参与DN的病理过程。

血管生成素样蛋白2真核表达载体的构建及在内皮细胞中的稳定表达研究

目的:构建血管生成素样蛋白2(ANGPTL2)真核表达载体和稳定过表达ANGPTL2的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。方法:以PCR的方法从载体phrGFP-C中扩增人源化绿色荧光蛋白基因hrGFP克隆到载体pIRES的B多克隆位点,构建成载体pIRES-hrGFP;利用合成的寡核苷酸在pIRES-hrGFP的骨架上引入一个便于载体线性化的多种限制性内切酶酶切位点,构建成载体pIRES-hrGFP-MS;以RT-PCR方法从人肾脏总RNA中扩增人ANGPTL2 cDNA,将其克隆到载体pIRES-hrGFP-MS的A多克隆位点,构建成ANGPTL2真核表达载体pIRES-hrGFP-MS-ANGPTL2。将线性化后的pIRES-hrGFP-MS-ANGPTL2以脂质体转染的方法导入HUVEC,利用药物筛选、绿色荧光观察以及ANGPTL2表达分析鉴定稳定过表达ANGPTL细胞株。结果:成功构建便于稳定转染的ANGPTL2真核表达载体pIRES-hrGFP-MS-ANGPTL2;得到了2个过表达ANGPTL2的HUVEC株GFP/ANGP1和GFP/ANGP2。光镜观察发现,ANGPTL2过表达细胞株GFP/ANGP1和GFP/ANGP2的形态由内皮细胞典型的铺路石状变为极度伸展的长梭形,提示ANGPTL2对内皮细胞可能有重要影响。结论:成功地构建了便于稳定转染的ANGPTL2真核表达载体;得到了稳定过表达ANGPTL2的内皮细胞株,为进一步揭示ANGPTL2的功能,探讨其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造了条件。

C3aR慢病毒表达载体的构建及在肾小管上皮细胞中的转染实验

目的前期研究发现C3aR在糖尿病肾病肾小管上皮细胞中表达上调,但其在糖尿病肾病中的病理意义未知,且有关肾组织C3aR的确切生理和病理意义亦仍不清楚。文中通过构建C3aR慢病毒表达载体和过表达C3aR的肾小管上皮细胞株,为探讨C3aR在肾组织小管上皮细胞中的确切生理和病理意义提供细胞模型。方法根据人C3aR mRNA序列合成人C3aR基因,将其克隆到慢病毒表达载体p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3aR慢病毒表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP;经测序验证正确后,用构建的慢病毒表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293T细胞,包装成C3aR表达重组慢病毒;以C3aR表达重组慢病毒感染人肾小管上皮细胞系HK2,经药物筛选得到杀稻瘟菌素抗性细胞克隆;经荧光定量PCR分析和细胞免疫化学分析,鉴定出稳定过表达C3aR的人肾小管上皮细胞株。结果 1对构建成的C3aR慢病毒表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP进行全序列测序验证显示序列完全正确。2以构建的C3aR慢病毒表达载体和包装质粒(p LP1、p LP2和p LP/VSVG)共转染293T细胞,48 h后收集细胞培养上清,得到了滴度约为5×108个/m L的慢病毒液。3成功进行了C3aR重组慢病毒对HK2细胞的转染,得到了稳定转染了C3aR重组慢病毒的HK2细胞株HK2-C3aR;基于荧光定量PCR和细胞免疫化学染色的分析证实HK2-C3aR细胞株中C3aR表达水平较HK2非转染对照细胞高(2.33±0.45 vs 1.00±0.09,P<0.05)。结论成功构建了C3aR慢病毒表达载体和过表达C3aR的人肾小管上皮细胞株,为进一步研究C3aR过表达在人肾小管上皮细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3aR在其他细胞中的生理、病理意义创造了条件。

C3aR过度活化与糖尿病肾病肾组织损伤的关系

C3aR是补体C3裂解产物C3a的受体.最近的一些研究提示C3aR通路可能参与了糖尿病肾病(DN)的病理过程,但有关C3aR通路在DN中的确切病理作用及有关机制远未清楚.需要特别指出的是,现有的有关C3aR参与DN肾组织损伤的证据主要来自一些动物模型的研究,临床上尚缺乏较为系统全面的对DN患者肾组织C3aR通路与肾组织损伤关系的观察分析.为此,本文首次以较大的样本量分析了不同病理时期DN患者肾组织C3aR和C3a的表达变化情况及其与DN患者肾组织损伤的相关性.在此基础上,进而利用体外细胞模型,对高糖环境下C3aR活化致肾小球足细胞损伤的作用及机制进行了探讨.结果显示:a.与正常对照组相比,DN患者肾组织C3a和C3aR的表达水平随DN的进展而升高,C3aR在DN患者肾组织中的表达上调主要见于肾小管上皮细胞和肾小球足细胞;b.DN患者肾组织C3aR和C3a水平与患者肾组织损伤程度,特别是小管和小管间质损伤程度、肾小球足细胞损伤程度具有显著相关性;c.外加C3a激活C3aR可使高糖环境中的足细胞的细胞骨架发生明显改变、足细胞标记分子表达下调、足细胞通透性增加.这些结果说明:a.DN患者肾组织中确实存在C3a/C3aR轴过度活化的现象;b.C3a/C3aR轴的过度活化很可能在DN患者肾组织损伤,特别是小管和小管间质损伤、肾小球足细胞损伤中具有重要作用;c.可能通过破坏成熟足细胞特有的细胞骨架,改变足细胞标记分子表达,增加足细胞的通透性,C3a/C3aR轴过度活化参与DN足细胞损伤过程.本文不仅为C3a/C3aR通路参与DN病理过程提供了新的必不可少的临床证据,也增加了对C3a/C3aR通路过度活化致DN患者肾组织损伤机制,特别是肾小球足细胞损伤机制的了解,这对于拓展对DN病理机制的认识,发展DN防治新思路,无疑都是有益的.

IgA肾病患者肾组织肥大细胞的分布及意义

目的:了解不同亚型IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)患者肾组织中肥大细胞的分布及其与各种疾病指标的相关性,全面探讨肥大细胞在IgAN中的可能病理意义。方法:选取包括大量蛋白尿型、反复发作肉眼血尿型、高血压型、无症状尿检异常型、血管炎型在内的IgAN患者共110例,根据肾组织肥大细胞特异性高表达C3aR的特点,利用免疫组化的方法对所有患者的肾穿刺活检标本切片进行C3aR免疫组化染色,计数各切片C3aR强阳性细胞数,同时测量切片面积,计算各患者肾组织肥大细胞分布密度(同时选取正常供肾15例作为对照);在此基础上,利用统计学方法,进行肾组织肥大细胞密度与包括血、尿生化指标,肾小管间质相对面积和肾组织炎症细胞密度在内的各种病理指标进行相关性分析,探讨肥大细胞在IgAN中的病理意义。结果:(1)肥大细胞广泛存在于各亚型IgAN患者肾组织中;与正常对照相比,各亚型IgAN患者肾组织中的肥大细胞数均有明显的增加。(2)总的来看,肾组织中肥大细胞数与血肌酐和血CystatinC水平、尿视黄醇结合蛋白(RBP)和尿溶菌酶水平及间质炎症细胞数量,肾小管间质相对面积具显著相关性,而与尿C3、尿α2巨球蛋白(α2-MG)和24h尿蛋白水平及尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)水平则无明显相关性。(3)不同亚型IgAN肾组织肥大细胞与各种病理指标的相关性有明显差异,其中,反复发作肉眼血尿型与其他亚型的差异性最明显。结论:肥大细胞很可能参与了包括大量蛋白尿型、反复发作肉眼血尿型、无症状尿检异常型、高血压型和血管炎型在内的各种亚型IgAN的病理过程。肥大细胞在不同亚型IgAN中的地位和作用机制也可能存在差异。

糖尿病肾病患者尿液糜蛋白酶检测及其病理意义分析

目的了解肥大细胞糜蛋白酶在糖尿病肾病患者尿液中的表达及其与糖尿病肾病临床指标的相关性,探讨糜蛋白酶和肥大细胞在糖尿病肾病肾组织损伤中的作用。方法收集糖尿病肾病103例(包括糖尿病肾病早期10例、中期31例和晚期62例)和20例正常对照者的尿液;利用ELISA法检测尿中糜蛋白酶水平;比较分析尿液糜蛋白酶在正常对照组、糖尿病肾病早期组、中期组和晚期组中的变化情况及其与患者各临床指标的相关性。结果与正常对照组相比,糖尿病肾病患者尿液中糜蛋白酶的水平显著升高,表现为随糖尿病肾病的发展而逐渐增加的趋势。糖尿病肾病患者尿液糜蛋白酶水平与血肌酐[相关系数(r)=0.446,P<0.01]、血胱蛋白酶抑制剂C(r=0.398,P<0.01)、血尿素氮(r=0.365,P<0.01)、24 h尿蛋白(r=0.512,P<0.01)、尿C3(r=0.321,P<0.01)、尿视黄醇结合蛋白(r=0.432,P<0.01)、尿溶菌酶(r=0.482,P<0.01)、尿N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(r=0.582,P<0.01)水平具有显著相关性。结论上述结果支持关于肥大细胞参与糖尿病肾病肾组织损伤的观点,提示肾组织肥大细胞及其分泌的糜蛋白酶很可能在糖尿病肾病肾组织损伤中具有重要作用并可能是糖尿病肾病防治的新靶标。

C3a分泌性表达载体及过表达C3a肾小管上皮细胞株的构建

目的已有的研究表明包括糖尿病肾病在内的多种肾病患者肾小管上皮细胞存在C3a/C3aR轴过度活化现象,但有关C3a/C3aR轴过度活化在肾小管上皮细胞中的病理意义未知。文中构建分泌性过表达C3a的肾小肾小管上皮细胞株,为探讨各种病理情况下C3a/C3aR轴过度活化的病理意义提供细胞模型。方法设计合成人C3a分泌性表达单元,将其克隆到慢病毒表达载体p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3a分泌性表达载体p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP;将p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞,包装成C3a表达重组慢病毒LV-C3a;以LV-C3a感染人肾小管上皮细胞系HK2,根据LV-C3a上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点,以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆;利用荧光定量PCR和ELISA方法对稳定转染细胞克隆的C3a表达水平和分泌情况进行分析,从中鉴定出稳定分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株。结果 1成功构建了序列完全正确的C3a分泌性表达载体p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP;2成功进行了重组慢病毒包装,得到了高滴度(5×108个/m L)的C3a表达重组慢病毒LV-C3a;3成功进行了LV-C3a对HK2细胞的转染,得到了稳定转染LV-C3a的HK2细胞株;基于荧光定量PCR和ELISA的分析证实,与HK2细胞比较,HK2-C3a细胞株中C3a mRNA表达水平显著升高[(1.0±0.5)vs(1 321.0±18.0),P<0.01],分泌的C3a水平显著升高[(0.3±0.2)ng/m L vs(249.0±37.0)ng/m L,P<0.01]。结论成功构建的C3a分泌性慢病毒表达载体和分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株为进一步研究各种病理情景中C3a/C3aR过度活化在人肾小管上皮细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3a/C3aR过度活化在其他细胞中的病理意义创造了条件。

含FLP“交换盒”结构的打靶载体构建及ES细胞打靶研究

利用小鼠HPRT基因组DNA片段和人工合成的含有FLP重组酶识别位点变异体FRT和F3RT序列的寡核苷酸 ,构建了针对小鼠HPRT基因位点的置换型打靶载体pSP HPRT F Neo F3。经过限制酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后 ,将线性化了的打靶载体以电穿孔法导入ES细胞内 ,经G418和 6 -TG双药筛选和分子鉴定 ,得到了 2个在HPRT位点整合有FLP重组酶“交换盒”F Neo F3结构的双交换重组ES细胞克隆 ,为建立基于FLP重组酶介导的盒式交换的高效。