肉鸡圆圈病毒3型和A型多杀性巴氏杆菌混合感染的检测与分析

为查明福建省龙岩市某鸡场肉鸡消瘦、呼吸困难、病死率升高原因,对发病鸡进行细菌分离鉴定、16S rDNA鉴定、荚膜分型检测、药物敏感试验等分析;以及进行病毒核酸PCR检测、遗传进化分析。结果显示,从病鸡中分离的细菌在血平板上形成圆形、微突起、表面光滑、奶油状的菌落;分离菌16S rDNA核苷酸序列与GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌的同源性达到99.9%以上,菌株荚膜为A型;该菌对哌拉西林、头孢氨苄、庆大霉素等药物均表现为高度敏感;从病鸡中检测出圆圈病毒3型(GyV3)VP2基因,与GenBank(登录号MK089248)GyV3同源性最高(99.9%)。结果表明,该鸡场发生圆圈病毒3型和A型多杀性巴氏杆菌引起的混合感染病例。

圆圈病毒3型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种检测圆圈病毒3型(Gyrovirus 3,GyV3)的TaqMan荧光定量PCR方法,为GyV3提供快速便捷的检测技术手段。【方法】根据NCBI数据库中GyV3 VP2基因保守区序列,设计一对特异性检测引物和一条标记FAM荧光基团的探针,经过条件优化,建立用于检测GyV3的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性以及模拟样品的检测试验。【结果】该方法灵敏性高,最低检测限度为1.585 copies·μL^(−1);特异性强,对其他常见禽病原不发生非特异性反应;重复性好,批内和批间变异系数均小于1%;对鸡肝脏组织DNA加入重组质粒制备的模拟样品同时进行TaqMan荧光定量PCR与SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测,均扩增出与预期相符的扩增曲线。【结论】首次建立用于检测GyV3的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法,具有灵敏性高、特异性强、重复性好等优点,为GyV3的诊断和流行病学调查提供了技术支持。

源自猪场环境大肠杆菌耐药性检测及其产ESBLs菌耐药基因特征

为了解猪场周边水和土壤环境中大肠杆菌耐药性及其中产ESBLs菌的耐药基因特征,用纸片扩散法检测了从福建省龙岩市5个规模化猪场周边水和土壤中分离的55株大肠杆菌对12种抗菌药的耐药性,并对其中产ESBLs菌进行了表型筛选;在此基础上,用CTX-M、TEM、SHV及OXA等4种ESBLs基因引物进行PCR检测与分析。结果表明,猪场环境分离的大肠杆菌对青霉素类、环丙沙星、四环素等耐药率较高,其中水源菌耐药率较高。55株大肠杆菌中,19株检出ESBLs基因,ESBLs检出率为34.5%。ESBLs基因型检测结果显示,CTX-M、SHV及TEM的检出率分别为23.6%(13/55),1.8%(1/55)和9.1%(5/55),未检出OXA基因。本试验结果表明,龙岩市猪场环境大肠杆菌对选用抗菌素耐药率较高,其产ESBLs菌的主要ESBLs基因型为CTX-M。

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验。结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green I染色后仅肉眼观察即可判定结果。该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR。该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV。

基于外膜蛋白Omp16的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测副猪嗜血杆菌(H.parasuis)抗体方法,本研究以H.parasuis外膜蛋白Omp16为包被抗原建立了检测H.parasuis的间接ELISA方法。反应条件经优化为:抗原包被浓度为1μg/m L,血清稀释度为1:80;血清与抗原最佳作用时间为40 min,二抗稀释10 000倍,与一抗孵育30 min;TMB作用时间为30 min。利用该ELISA方法检测H.parasuis、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌和猪链球菌2型等血清,除H.parasuis为阳性外其余均为阴性,表明其特异性强。该ELISA方法可检测到最高稀释度为1∶512的阳性血清,敏感性高。重复性试验显示,其批内和批间的重复试验变异系数(CV)分别在3.62%~8.97%和4.3%~9.50%。该ELISA检测方法与进口ELISA试剂盒的阳性符合率、阴性符合率和总体符合率分别为87.8%,90.7%和88.6%。本研究建立的间接ELISA方法,为H.parasuis血清流行病学调查及疫苗免疫评价等提供了重要手段。

龙岩市仔猪病毒性腹泻检测与分析

腹泻是危害猪场最严重的疾病之一,尤以仔猪腹泻发病更为严重。腹泻的病因有多种,其中传染病是一个主要因素,引起仔猪腹泻的传染病中,危害最大的是猪传染性胃肠炎（TGE）,猪流行性腹泻（PED）及猪轮状病毒（RV）感染等病毒性腹泻。TGE是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病,发病急,传播快,

胞内劳森菌SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法的建立

【目的】建立检测胞内劳森菌的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,为猪增生性肠炎的准确诊断奠定基础。【方法】针对胞内劳森菌16SrDNA序列设计引物,扩增16SrDNA,构建pT-LI-16S重组质粒。以pT-LI-16S为模板建立检测胞内劳森菌的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,检测其特异性、敏感性和重复性,并用该方法对51份疑似增生性肠炎病例进行检测。【结果】建立的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法特异性强,与大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和副猪嗜血杆菌等无交叉反应;在标准质粒含量为1.0×10^2-1.0×10^8拷贝/μL时,质粒含量与循环阈值（Ct）之间具有良好的线性关系（R^2=0.992）,最小可检测到10拷贝/μL的重组质粒;重复性检测显示其批内变异系数小于2%。该方法对粪便及小肠组织中胞内劳森菌的检出率分别为46.9%和84.2%,高于普通PCR的检出率（分别为40.7%和78.9%）。【结论】建立的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,能对胞内劳森菌进行快速检测及定量分析,可用于猪增生性肠炎的诊断。

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立

通过设计三对引物分别扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪轮状病毒(RV)的特异性基因,建立了一个能对TGEV、PEDV及RV感染鉴别诊断的三重PCR方法。该方法能同时检测TGEV的M基因252bp片段、PEDV的N基因540bp片段及RV的VP7基因412bp片段,而对CSFV、PCV2、PRRSV、PRV等无扩增,其检测TGEV、PEDV及RV的极限为100pg核酸/μL;用该方法对临床收集的26份粪便样品进行检测,结果表明:建立的多重PCR方法具有特异性强,强灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查。

猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种具有敏感性高、特异性强、方便、快速等特点的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的环介导等温扩增技术(LAMP),针对美洲型PRRSV的ORF5基因设计了一套LAMP引物,建立了LAMP反应体系,并对其敏感性、特异性等进行了评估。结果表明,该方法可在65℃、1h内完成最低限度5.49pg/μL含量的PRRSV核酸扩增,结果仅肉眼就能判定。该检测方法特异性强,与猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪伪狂犬病病毒(PRV)等病原体无交叉反应;对25份临床样品检测表明,该方法的检出率高于常规RT-PCR法,且操作更为方便、快速。该检测方法特异、敏感、准确,可应用于临床检测PRRSV。

猪增生性肠炎诊断技术研究进展

猪增生性肠炎是由胞内劳森氏菌引起的一种肠道传染病,临床表现以慢性型及亚临床型为主。猪增生性肠炎易造成猪饲料转化率低,生长速度慢。猪增生性肠炎在全球猪场流行,其发病率呈上升趋势,造成了重大经济损失。目前,国内对该病的研究较薄弱,应引起足够的重视。作者综述了猪增生性肠炎的诊断技术研究进展。

猪源产ESBLs大肠杆菌三种耐药基因检测及分析

了解福建省闽西地区猪源产ESBLs大肠杆菌耐药现状。从龙岩市10个规模猪场分离的大肠杆菌中,按CLSI推荐的纸片扩散法筛选产ESBLs菌,对其分别用CTX-M、TEM和SHV等3种引物进行PCR扩增及测序分析。结果表明,105株大肠杆菌的产ESBLs检出率为28.6%(30/105);其ESBLs基因亚型以CTX-M型和TEM型为主,检出率分别为56.7%(17/30)和36.7%(11/30),SHV型检出率13.3%(4/30)较低;5株菌同时携带CTX-M和TEM基因,2株菌同时携带CTX-M和SHV基因;测序结果表明,共检测出3种基因型:CTX-M-15、TEM-2和SHV-12。

副猪嗜血杆菌和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞免疫分子表达的影响

副猪嗜血杆菌(Hps)是猪上呼吸道常见条件致病菌之一,在临床上Hps和圆环病毒2型(PCV2)混合感染加剧了断奶仔猪多系统衰竭综合征的症状。为探讨Hps和PCV2共感染的致病机制,本试验建立了体外Hps和PCV2共感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)的模型,分别检测感染12、24 h和36 h后的PAM细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-10)、猪白细胞抗原(SLA)分子SLA-DR、SLA-DM以及共刺激分子CD 80和CD 86的mRNA转录水平,以探讨其动态变化规律。结果显示,与单一感染相比,Hps和PCV2共感染的PAM在感染24 h内,IL-1β和TNF-α表达水平显著上升(P<0.05),而IL-4和IL-10表达显著下降(P<0.05);在感染36 h内,CD 80、CD 86及SLA-DM、SLA-DR的表达水平显著下降(P<0.05)。结果表明,Hps和PCV2共感染增进了PAM促炎症因子表达,抑制了PAM抑炎因子表达及外源性抗原加工和递呈相关分子表达,从而消弱了其免疫功能。

猪圆环病毒2型与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断

2007年4月,龙岩市某存栏母猪达200头的规模化猪场,保育栏仔猪出现体温升高,呼吸困难,咳嗽,耳、鼻端、四肢及下腹部皮肤发紫,经临床剖检及病理观察大体判断为圆环病毒2型与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染,为进一步确诊,进行了实验室诊断。分别设计了PCV2及PRRSV的扩增引物,结果从病例中扩增出相应的产物。通过临床、病理诊断及实验室检测,确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒与圆环病毒2型混合感染。

应用型本科院校动物医学专业产教融合人才培养模式构建与实践

产教融合是高等学校提高应用型人才培养质量的重要途径。龙岩学院动物医学专业近年来在产教融合人才培养模式构建中进行了一系列实践探索,主要改革措施包括优化培养方案,重构了通识教育课、公共基础课、专业基础课、专业核心课和专业方向课构成的课程体系,其中专业方向课包含卓越兽医师模块课程、智慧养殖模块、农产品加工模块、农牧商务与金融模块和兽医制药模块等5个方向模块课程;实行"3+1"培养模式,强化了专业实践教学环节,实践教学总学分占比达41.5%;实施"双师同堂"教学、加强产教融合师资队伍建设、共建产教融合教研平台和创新校企合作项目管理等教学教育改革方案,取得了明显成效。

载副猪嗜血杆菌PLGA Omp16蛋白微球的制备及其免疫效果的初步研究

为研究载副猪嗜血杆菌(H.parasuis)外膜蛋白Omp16 PLGA微球的生物学特性,本研究以H.parasuis外膜蛋白Omp16为芯材,聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为壁材,通过复乳溶剂挥发法制备PLGA微球疫苗。通过扫描电镜测定微球的形态、激光粒径仪测定微球的粒径分布。结果显示,PLGA微球呈球性,表面圆整,粒径分布较窄,平均粒径为5.2μm;采用BCA法测定微球的包封率和载药率,结果显示,微球的包封率为70.5%,载药率为5.78%;以透析释药法测定微球的体外释放特性,结果显示,微球体外释放42 d累计释放抗原95.3%。用该微球0.2 mg/次,免疫小鼠二次(间隔14 d)后,采用ELISA法测定小鼠抗H.parasuis IgG水平,结果显示,微球佐剂组小鼠H.parasuis IgG抗体水平显著高于灭活疫苗组(p<0.01);腹腔注射H.parasuis LY02株(血清5型)进行攻毒保护试验,结果显示,微球佐剂组小鼠攻毒保护率(81.8%)显著高于灭活疫苗组(63.6%)(p<0.05)。以上试验结果表明,制备的PLGA微球具有良好的缓释性能,能增强小鼠体液免疫应答,提高H.parasuis攻毒保护率。本研究为H.parasuis亚单位微球疫苗的制备奠定基础。

猪源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性检测

猪大肠杆菌病,如仔猪的黄、白痢、水肿病,是由致病性大肠杆菌引起的一种猪的急性传染病,是引起仔猪死亡的重要原因之一,对养猪业造成了较大的威胁和重大的经济损失。大肠杆菌病疫情发生后,临床上常用抗生素进行治疗,尽管疫情能得到一定程度的控制,但细菌的耐药性日益严重，特别是多重耐药性问题突出。

银杏叶提取物对断奶仔猪生长性能、血清生化指标和激素水平的影响

【目的】研究银杏叶提取物(EGB)对断奶仔猪生长性能、血清生化指标和激素水平的影响,为银杏叶的开发应用提供依据。【方法】将160头25日龄的"杜×长×大"三元杂交断奶仔猪按公母各半、体质量接近的原则,随机分为4组,每组4个重复,每个重复10头,分别饲喂添加质量分数0%,0.1%,0.2%和0.3%EGB的基础日粮,试验期为28 d,测定断奶仔猪生长性能、血清生化指标和激素水平。【结果】日粮中添加质量分数0.2%和0.3%EGB可显著提高断奶仔猪平均日增质量(P<0.05),降低料质量比(P<0.05);显著降低断奶仔猪血清尿素氮和血糖浓度(P<0.05),提高血清碱性磷酸酶活性和血清生长激素、三碘甲腺原氨酸水平(P<0.05)。【结论】日粮中添加质量分数0.2%和0.3%EGB,可改善断奶仔猪血清生化指标,提高生长相关激素水平,促进仔猪生长。

鸽圆环病毒浙江株△Cap基因的克隆与原核表达

根据已发表的鸽圆环病毒(PiCV)序列,在V1ORF保守序列部位设计引物(目的片段长度为629bp),对浙江某鸽养殖场的病料进行PCR扩增检测,获得阳性样品;应用设计的删除核定位信号外壳蛋白基因(△Cap)的引物,扩增获得680bp的△Cap基因,克隆于pMD18-T载体,进行测序;将△Cap基因亚克隆到原核表达载体pET-28a进行融合表达,SDS-PAGE电泳检测发现,△Cap融合蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的22.1%。

鹅圆环病毒浙江永康株全基因组的克隆及序列分析

为研究水禽流感大规模爆发的机理,进行了水禽流感病例中并发病原,特别是免疫抑制性病原的检测研究。根据已发表的鹅圆环病毒(Goosecircovirus,GoCV)序列,设计了一对检测引物,对浙江永康禽流感病死鹅样品进行PCR扩增,获得与预期552bp大小相符的DNA片段,经测序确认为GoCV特异序列,推测样品中存在GoCV。根据测定的序列进一步设计反向扩增引物,经扩增、测序、拼接后获得GoCV全长基因组序列。基因组序列分析表明,浙江永康株GoCV_yk01全长1821bp,具有圆环病毒共同的与病毒复制相关的茎环结构和Rep蛋白保守基序等特征,它与德国、中国台湾发表的序列在全基因组水平有91%～93%的同源性,在Rep和外壳蛋白的氨基酸水平有94%～97%的同源性。应用ClustalW方法作进化树分析显示,GoCV_yk01序列与德国株及中国台湾株均不在同一分支。圆环病毒可以感染淋巴细胞等增殖快的细胞,引起免疫抑制,从而造成其他病原的并发和继发感染,怀疑GoCV可能在2004年初永康爆发的鹅流感中起到了一定的协同作用。该GoCV_yk01是中国内地首次检测确认并测定全基因组序列的鹅圆环病毒。