EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪细小病毒方法的建立

目的建立以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测猪细小病毒(PPV)的方法,为血液制品中病毒去除效果的工艺验证提供高效准确的技术平台。方法根据PPV的VP2基因保守序列,设计并合成引物。对目的片段进行PCR扩增,将扩增的PPV病毒VP2基因片段克隆入PMD19-T载体,重组质粒PMD19-T-VP2经测序鉴定正确后,作为标准品模板,用于标准曲线的绘制和该实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性检测的材料。结果应用重组质粒PMD19-T-VP2制作的荧光定量PCR扩增曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系;该方法检测灵敏度的下限能达到102copies/μl;与其他DNA病毒和同种属的细小病毒无明显的交叉反应;连续重复检测高、中、低浓度样品,批内批间变异系数小,重复性好。结论以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测PPV的方法提高了检测灵敏度,缩短了工艺验证的时间。

S/D法和低pH孵放法在富含IgM免疫球蛋白中脂包膜病毒的灭活研究

目的以水泡性口炎病毒(VSV)、辛德毕斯病毒(Sindbis)和伪狂犬病毒(PRV)为指示病毒,验证S/D和低pH孵放2种处理方法对富含IgM制剂的脂包膜病毒灭活效果。方法将指示病毒加入富含IgM制剂中,在无保护剂状态下,分别经S/D和低pH孵放处理后,测定残余病毒滴度,以病毒滴度下降数代表灭活效果。结果 S/D法使PRV和Sindbis的病毒滴度下降分别为2.94和5.25 Logs;低pH孵放使PRV和VSV的病毒滴度下降分别为6.03和4.94 Logs。结论 S/D法和低pH孵放2种处理方法对脂包膜病毒的模拟病毒VSV、Sindbis和PRV病毒,均能有效灭活。

治疗性单克隆抗体

目前全世界约有80种治疗性单克隆抗体(McAb),其中20种已在进行临床试验.大多数治疗性McAb以癌细胞为目标,许多McAb既可用作治疗剂,又可用作体内诊断剂.把重点放在人源化McAb,起因于两个公认的观点:治疗性抗体的人源化越差,其抗原性危险越不易被人们所接受;人源化McAb可提高制品的临床效果.

IVIG巴氏灭活的最佳条件

目的为了提高静脉注射人免疫球蛋白（WIG）制品的病毒安全性，探索其巴氏灭活的可行性。方法在不加保护剂的条件下，调整不同的蛋白浓度、pH、电导，对IVIG液体样品进行巴氏灭活，并作各种理化性质分析。结果以制品分子大小分布为主要指标，优选出蛋白浓度1．0％～1．5％、pH3．8～4．2、电导值低于0．3ms的巴氏灭活条件。结论所用条件可在不加保护剂的情况下进行巴氏灭活时，加热对静脉注射人免疫球蛋白制品性质影响最小。

四川地区健康供血浆者SARS-CoV抗体血清学反应初探

目的探索四川地区健康供血浆者SARS-CoV抗体血清学反应情况及其是否对SARS-CoV具有中和作用。方法采用SFDA批准的SARS CoVIgG ELISA试剂盒筛查四川地区7127名健康供血浆者的7248份合格血浆,采用蚀斑中和试验测定单份阳性血浆。结果7248份合格血浆中SARS CoVIgG抗体阳性率平均为5.61%;7127名健康供血浆者中抗体阳性率为3.93%,其中S/CO值>5的阳性率为0.22%。ELISA检测强阳性的单份血浆的最高蚀斑中和抗体效价为166。结论四川地区健康供血浆者中的确存在对SARS-CoV抗体的血清学反应,原因有待于进一步的研究。

QPCR检测人细小病毒B19方法的建立及其在病毒去除工艺验证中的应用

目的建立1种检测人细小病毒(B19)的荧光定量PCR方法,并应用于纳米膜过滤去除病毒的工艺验证,评价在血液制品生产过程中纳米膜过滤去除B19的效果。方法用上游引物(P1)5’-GGC ACC TCT CAA AAC ACT-3’和下游引物(P2)5’-C CAC TCC TTG CTG ATA CTC-3’,在95℃3min、95℃10s52℃10 s72℃10S条件下扩增40个循环,建立检测B19的QPCR方法并验证该方法的专一性、重复性和灵敏性;最后用该方法检测纳米膜过滤去除制品中B19的效果。结果该方法实验内和实验间的精密度均<5%,最低检测限为50 copies/μL;经检测纳米膜过滤可使样品中B19滴度下降3.8Logs。结论成功建立了具有良好专一性、重复性和灵敏性的荧光定量PCR方法。

荧光定量RT-PCR检测脑心肌炎病毒方法的建立及初步应用

根据GenBank中公布的脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus EMCV)3D基因保守区段设计并合成1对引物,以提取的EMCV核酸为模板,分别进行荧光定量RT-PCR扩增,优化反应体系及条件,建立脑心肌炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并初步运用于静注人免疫球蛋白(IVIG)纳米膜过滤工艺去除EMCV效果的验证.结果显示该方法实验内和实验间的精密度均小于5%,最低检测限为102copies/μL;纳米膜过滤工艺可使样品中的EMCV滴度下降4Logs.

猪细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法 根据GenBank中登录的PPV NADL-2株序列,针对VP2区设计引物,以提取的PPV核酸为模板,进行荧光定量PCR扩增;优化反应体系及反应条件,并进行专属性、重复性和敏感性验证。用建立的荧光定量PCR法检测辛酸沉淀及L、P、S公司生产的纳米膜过滤器去除制品中PPV的效果。结果 优化后的荧光定量PCR反应体系：Eva Green预混液7.5μl,上下游引物各0.5μl,模板DNA 1μl,补加dH2O至15μl;反应条件：95℃3 min,95℃10 s和60℃10 s,共40个循环;模板浓度的对数值与循环数的相关性较好（R2=0.999）,扩增效率为102.5%。该方法可特异性扩增PPV,而对伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）、牛细小病毒（bovine parvovirus,BPV）、鼠细小病毒（minute virus of mice,MVM）及猪肾细胞PK-15无扩增反应;试验内CV为0.79%～2.81%,试验间CV为1.23%～2.21%,均〈5%,最低检测限为102copies/μl。辛酸沉淀可使样品中PPV浓度下降5 Logs;不同公司生产的20 nm膜滤器过滤量及过滤效果均有明显差异,其中S公司生产的滤器效果最好,可使样品中的PPV滴度下降4 Logs。结论 已成功建立了PPV荧光定量PCR检测方法,为快速、准确的检测病毒去除工艺对PPV的去除效果奠定了基础。

静注人免疫球蛋白新生产工艺病毒灭活/去除效果的验证及评估

目的对静注人免疫球蛋白(intravenous human immunoglobulin,IVIG)新生产工艺的病毒灭活/去除效果进行验证及评估。方法选择4种脂包膜病毒[人免疫缺陷综合征病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SV)和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)]及非脂包膜病毒[猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)]作为验证病毒,在缩小的生产规模条件下考察辛酸钠沉淀/深层过滤、低pH孵放和纳米膜过滤步骤对一种或几种指示病毒的灭活/去除能力。结果辛酸钠沉淀/深层过滤步骤可灭活/去除PPV 1.88 Log;低pH孵放对HIV、PRV、SV和VSV的灭活效果最低分别为≥5.22、≥4.26、≥6.56和≥5.69 Log;Bio EX纳米膜可去除PPV达4 Log以上。结论 IVIG新生产工艺的病毒灭活/去除效果合格,可有效灭活/去除未知的、新出现的病原体。

高滴度呼肠孤病毒3型的制备及滴度检测

目的 制备高滴度呼肠孤病毒3型（reovirus 3,Reo-3）病毒液,并检测Reo-3滴度.方法 以幼仓鼠肾细胞（BHK-21）为病毒培养基质和滴度测定细胞.将Reo-3按10^0至10^-5感染复数（MOI）接种BHK-21,再分别用细胞病变法和蚀斑形成法检测病毒,用Karber法计算病毒滴度.结果 BHK-21感染Reo-3后能产生明显病变.以10^-4 MOI的Reo-3接种后48 h,收获液中病毒滴度最高,细胞病变法检测为9.625 lgTCID50/ml,蚀斑形成法检测为8.671 lgPFU/ml.结论 制备了高滴度Reo-3,为开展该病毒去除灭活研究奠定了基础.