安图A2000全自动化学发光分析仪检测IGFBP3的性能验证及与IGF-1相关性研究

目的:对安图A2000全自动化学发光仪检测血清胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)的性能进行评价,并探讨其在矮小症、性早熟及垂体性病变中与IGF-1的相关性。方法:对安图A2000系统检测IGFBP3的精密度(CV)、线性范围、可报告范围、参考区间进行验证。选取2023年1月-2023年9月在本院诊断或治疗的矮小症21例、性早熟10例、垂体性病变19例,回顾性分析其胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-1)和IGHBP3水平,并进行Spearman相关性分析。结果:IGFBP3高低水平质控品批内CV为2.019%、2.931%,批间CV为3.818%、4.137%;测定结果在0.3~16.0μg/mL范围内呈线性,线性回归方程为Y=0.9995X~0.0213,R2=0.9974;临床可报告范围为0.3~32.0μg/mL;18~70岁和>70岁健康体检者检测结果均在厂家提供的参考区间内;IGFBP3和IGF-1在矮小症、性早熟和垂体性病变患者中具有较好的相关性(r=0.81,P<0.0001)。结论:安图A2000检测血清IGFBP3的性能能够满足实验室质量要求,且与IGF-1具有较好的相关性。

山东省大肠癌影响因素病例对照研究

目的探讨大肠癌发病的危险因素,为监测和预防提供科学依据。方法采用以医院和社区为基础的1∶2病例对照研究,用统一的调查表对山东省1869例大肠癌患者及3738例对照进行调查。应用条件Logistic回归分析对大肠癌患者进行单因素和多因素分析。结果猪肉摄入频次、油炸食品摄入频次、高温烧烤肉类摄入频次、肠息肉史、黏液血便、精神刺激史及直系亲属患大肠癌史是大肠癌的危险因素,其OR值依次为2.375,2.383,2.706,11.024,5.365,2.553,2.527;喜食大蒜、粗纤维饮食和轻体力劳动是保护因素,OR值为0.532,0.784,0.739;吸烟、饮酒、饮茶、水果、奶制品摄入与大肠癌的发病未见明显关联。结论大肠癌发生与饮食、情绪、消化道疾病及遗传有关,而喜食大蒜是大肠癌的保护因素。

缺氧下5-脂氧合酶在卵巢癌中的表达及意义

目的:检测缺氧环境下5-LOX在卵巢癌中的表达及与临床参数间的关系,探讨其在卵巢癌发生发展及治疗中的意义。方法:免疫组化检测56例卵巢癌组织中5-LOX与HIF-1α表达,并分析5-LOX表达与卵巢癌临床参数之间的关系。体外将人卵巢癌SKOV3细胞在缺氧环境下培养0、12、24h和48h,分别提取RNA和蛋白。qRT-PCR法和Western blot法分别检测5-LOX mRNA和蛋白表达;ELISA法检测缺氧环境下卵巢癌细胞5-LOX代谢产物5-HETE的变化。结果:5-LOX与HIF-1α表达具有明显的相关性,其表达水平与患者的淋巴结转移、远处转移和临床分期密切相关。缺氧条件下培养的SKOV3细胞的5-LOX在转录和蛋白水平均表达升高;缺氧条件下卵巢癌细胞培养上清的5-HETE较常氧条件下明显升高。结论:缺氧能促进卵巢癌5-LOX表达及增加代谢产物5-HETE的产生,提示5-LOX可作为治疗卵巢癌的潜在靶点,这为卵巢癌的发病机理研究和诊治提供了新的思路与方法。

大肠癌组织中HLA-I类分子的表达及意义

目的探讨大肠癌组织中HLA-Ⅰ类分子表达及其在大肠癌转移中的意义。方法以化学发光法检测81例大肠癌患者术前血清癌胚抗原(CEA)含量;每例患者术中取癌组织及癌旁组织．采用免疫组化SP法检测HLA-Ⅰ类分子．结果大肠癌组织中HLA-Ⅰ阳性率为43．2%(35/81),其中A期73．3%、B期55．6%、C期25．9%,D期16．7%．各期间相比P均＜0．01。转移组大肠癌患者HLA-Ⅰ类分子阳性率为23．1%,未转移组为61．9%,二者比较,P均＜0．01．在转移组大肠癌患者中．癌组织HLA-Ⅰ类分子缺失率(76．9%)高于血清CEA阳性率(51．3%)．结论大肠癌组织中HLA-Ⅰ类分子的表达缺失是大肠癌发生及转移的重要因素．检测HLA-Ⅰ类分子表达还有助于大肠癌转移及预后判断。

乙型肝炎病毒感染与宿主淋巴细胞HLA-Ⅰ类分子关系的研究

目的:检测慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌患者外周血淋巴细胞HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ类分子表达,并探讨其在宿主细胞免疫状态中的作用。方法:采用流式细胞术(FCM)检测51例正常人5、8例慢性乙型肝炎、31例肝硬化1、3例肝癌患者外周血淋巴细胞表面HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ类抗原的表达。结果:慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者外周血淋巴细胞HLA-Ⅰ类分子平均荧光强度分别为335.80、309.78、114.04,均较正常对照组(565.08)降低(P<0.01),且随病情加重逐步降低。正常对照、慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者HLA-Ⅱ类分子表达率分别为32.50%、38.28%、42.21%、52.75%,其中肝硬化组和肝癌组与正常对照组差异有统计学意义(P<0.01),慢性乙型肝炎组和正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞HLA-Ⅰ类分子表达降低,肝硬化和肝癌患者降低更为显著,这与患者细胞免疫功能紊乱密切相关。

人结直肠癌细胞表面HLA-I类抗原下调与抗原加工递呈相关基因TAP1、TAP2、LMP2、LMP7表达关系的研究

目的研究结直肠癌肿瘤细胞HLA-I类分子与抗原加工递呈相关基因的表达关系,探讨结直肠癌肿瘤细胞HLA-I类分子的表达下调机制。方法通过免疫组化检测74例不同Dukes分期直肠癌细胞HLA-I类分子,以RT-PCR技术检测其中35份相应标本TAP1、TAP2、LMP2、LMP7基因的表达。结果结直肠癌细胞表面HLA-I类分子表达异常相当普遍,I类分子阳性表达率为41.9%(31/74);随Dukes分期进展,I类分子阳性表达率逐渐降低,A期73.6%(14/19)、B期53.6%(15/28)、C期25.0%(4/16)、D期18.2%(2/11),转移组24.0%(6/25)比未转移组57.1%(16/28)显著降低;表达I类分子的肿瘤细胞TAP1、TAP2、LMP2、LMP7基本正常,未表达I类分子的肿瘤细胞至少有一种基因异常,其中TAP1与I类分子表达缺陷的关系更为密切。结论结直肠癌HLA-I类分子表达异常,其异常表达与TAP1、TAP2、LMP2、LMP7等I类抗原加工递呈基因异常有关。

乙酸乙酯萃取尿游离皮质醇性能验证

目的:评价DXI800检测系统乙酸乙酯萃取法检测尿游离皮质醇的性能,探索建立乙酸乙酯萃取尿游离皮质醇的规范流程。方法:参考美国临床实验室标准化协会(NCCLS)文件,制定性能验证的方案。评价DXI800检测系统测定尿游离皮质醇的正确度、检测范围、批内精密度及批间精密度;并分析换溶复溶剂、震荡时间、离心速度、储存时间等因素对乙酸乙酯游离皮质醇萃取效率中的影响。结果:检测系统测量正确度,最大偏倚为3.11%;标准物质批间精密度为4.38%;乙酸乙酯萃取游离皮质醇最大效率为93.39%;低、高两水平尿液游离皮质醇萃取批内精密度分别为2.17%、1.92%;批间精密度分别为3.30%、2.61%;分析不同换溶复溶剂对萃取效率的影响,结果显示20%分析纯乙醇溶液复溶回收率最高(P<0.05),皮质醇零浓度定标液复溶回收率最低(P<0.05)。尿液萃取时震荡30s,4000r/min离心效果最好(P<0.05),尿液采集后48h内检测差异无统计学意义(P>0.05)。结论:DXI800检测系统测定尿游离皮质醇正确度高,精密度好,检测性能可满足临床需求。乙酸乙酯可有效萃取尿游离皮质醇,20%乙醇溶液是较好的游离皮质醇换溶复溶剂。

基于乳头溢液标志物的乳腺良恶性疾病鉴别诊断模型的建立及价值评估

目的:检测CA125,CA153,CA199,CA724和CEA在乳腺癌和乳腺良性疾病患者乳头溢液中的表达,探讨其在乳腺良恶性疾病中的鉴别诊断价值。方法:回顾性分析73例乳腺癌和189例乳腺良性疾病患者的乳头溢液中CA125,CA153,CA199,CA724和CEA的表达,上述标志物的检测均采用采用罗氏电化学发光方法。t检验统计分析上述标志物在乳腺癌组和良性疾病组的表达差异;ROC曲线评价CEA和CA153的鉴别诊断价值,并结合患者年龄、CEA和CA153建立鉴别诊断模型;采用Pearson8t检验分析CEA和CA153在乳头溢液和血清中的相关性。结果:乳腺癌组乳头溢液中CEA(1430.09±259.29)和CA153(4058.82±119.4)的表达显著高于乳腺良性疾病组(141.33±296.34,1402.28±306.04)(P<0.001,P<0.01),但CA125,CA724,CA199在乳腺癌患者组与良性乳腺疾病组之间无显著性差异(P=0.28,0.84,0.58);CEA和CA153对乳腺良恶性疾病鉴别诊断的最佳Cut-off值分别为230.88ng/ml和639.68U/ml。CEA的曲线下面积为0.828,显著优于CA153(0.709,P=0.0004)。将年龄、CEA和CA153联合应用建立鉴别诊断模型,得到公式:-4.525+0.060*年龄+0.056*CEA+0.002*CA153,以0.73为Cut-off值,其敏感性和特异性分别为100%和95.2%;CEA在乳头溢液和血清中的表达呈正相关(r=0.9690,P<0.0001),而CA153在乳头溢液和血清中的表达无相关性(r=0.01577,P=0.95)。结论:乳头溢液CEA和CA153是较好的乳腺良恶性疾病鉴别诊断标志物,与年龄联合建立鉴别诊断模型具有更优的价值。

基于多检验变量和机器学习算法的结肠癌诊断模型建立及价值评估

目的 采用不同机器学习算法,建立基于多检验变量的结肠癌诊断模型,并评估其临床应用价值。方法 收集119例结肠癌患者(结肠癌组)和125例健康对照(健康对照组)的血清样本,提取血清外泌体,采用RT-qPCR方法测定miR-214-3p分子在两组中的表达水平,进而绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线,评估其对结肠癌的诊断效能。同时,收集结肠癌组和健康对照组的常规检验项目结果。将以上指标均纳入研究筛选出特征性变量,采用11种不同算法结合ROC曲线和机器学习曲线综合评价筛选出最优算法,建立结肠癌诊断模型。结果 结肠癌组血清外泌体中miR-214-3p的表达水平明显高于健康对照组(P<0.001),其诊断结肠癌的ROC曲线下面积(area under curve, AUC)为0.820,具有较好的诊断效能。将结肠癌组和健康对照组的血清外泌体miR-214-3p及30种常规检验指标纳入后,筛选出尿素、癌胚抗原、单核细胞计数、外泌体miR-214-3p共4个特征性变量,且逻辑回归算法是建立机器学习模型的最优算法,其AUC为0.93,且学习曲线呈现很好的拟合状态。结论 血清外泌体miR-214-3p是结肠癌的潜在标志物,基于4个特征性变量和逻辑回归算法建立的机器学习模型对结肠癌有良好的诊断效能。

全人源抗前列腺癌ScFv抗体的筛选及生物学特性研究

目的从已成功建立的前列腺癌噬菌体抗体库中筛选抗人前列腺癌单链抗体(ScFv),并分析其生物学特性。方法以良性前列腺增生(BPH)细胞与噬菌体抗体库共孵育,去除抗体库中能够与BPH细胞结合的噬菌体抗体,再以前列腺癌细胞系DU145与去除非特异性结合后的噬菌体抗体库共孵育,通过"吸附-洗脱-扩增"对前列腺癌的噬菌体抗体库进行3轮的富集。采用流式细胞术筛选出对人前列腺癌细胞系DU145高亲合力的阳性克隆。阳性噬菌体克隆经亚克隆并转染大肠杆菌TG1,表达出可溶性ScFv抗体。采用流式细胞术、免疫荧光法分析其生物学特性。结果以前列腺癌细胞系DU145为抗原,筛选出19个噬菌体抗体,经测定C11与DU145细胞亲合力最高,亚克隆至原核表达载体表达纯化为C11 ScFv抗体。流式细胞术和免疫荧光法检测结果均显示,C11ScFv抗体与前列腺癌细胞DU145和PC3结合,与BPH细胞不结合。结论通过噬菌体展示技术筛选到前列腺癌细胞系高亲合力的可溶性ScFv抗体,为进一步研究抗体的靶向性治疗奠定了基础。

化学发光微粒子免疫法检测人附睾蛋白方法学性能评价

目的对Abbott Architect i2000SR检测系统应用化学发光微粒子免疫技术定量测定人附睾蛋白(HE4)的分析性能进行评价。方法参考美国临床实验室标准化协会(NCCLS)文件,制定定量检测方法的方法学评价方案,通过Abbott Architect i2000SR检测系统测定HE4的批内精密度、批间精密度、线性范围、携带污染率和参考区间。结果低、高值混合血清批内精密度CV分别为1.80%、2.34%;批间精密度CV分别为2.03%、2.70%;线性范围为19.8～1 573.5 pmol/L;携带污染率为-0.02%;参考区间为0.0～140.0 pmol/L。结论 Abbott Architecti2000SR检测系统测定HE4的精密度好、线性范围宽、携带污染率低,参考区间与厂家提供的一致,检测性能可满足临床要求。

应用液相基因芯片技术筛查山东地区高危人群人乳头瘤病毒基因型

目的 评价Luminex XMAP系统的液相芯片技术在女性生殖道人乳头状瘤病毒（HPV）感染检测中的临床价值,调查山东地区女性生殖道HPV感染情况及最常见的基因型。方法 取妇科门诊就诊者宫颈脱落细胞2925例,采用液相芯片技术进行HPV基因型检测,96孔板操作,26种亚型1次呈现。639例患者同时做病理诊断,按组织病理学分为细胞学正常组、炎症组、宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ组、CINⅠ-Ⅱ组、CINⅡ组、CINⅢ组和宫颈癌组。通过HPV DNA亚型分布结合病理诊断,分析山东地区HPV感染基因型与宫颈病变程度的关系。结果 HPV总感染率36．0% （1054/2925）,26种基因型检出23种,按感染率从高到低依次为HPV-16（26．75%）,HPV-52 （25．75%）,HPV-58（10．47%）,HPV-18（8．87%）和HPV-11（6．94%）。其中高危型感染占87．32%,低危型13．68%;单一型感染698例（66．22%）,多重感染356例（33．78%）,低危亚型11、6多与高危型多重感染。1054例HPV阳性患者中,261例（24．8%）为21～25岁女性,随年龄增大阳性例数减少, 52例（4．9％）为51～67岁女性。各病理组HPV阳性率及多重感染率依次为正常组23．37％、4．89％，炎症组33．08％、7．14％，CINI组54．54％、18．18％，CINⅠ-Ⅱ组57．14％、28．57％，CIN Ⅱ组82．61％、41．30％，CINⅢ组91．30％、43．37％，宫颈癌组100％、38．46％。以组织病理学为确诊标准，液相芯片HPVDNA检测CINⅡ、Ⅲ和宫颈癌的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值依次为88．57％、76．63％、68.89％和92．16％。结论 所选山东地区高危人群HPV感染的常见基因型是16、52、58、18、11、6、56、31。随宫颈病变程度加重，HPV感染率及多重感染有增加趋势，HPV阳性以年轻女性多见。液相芯片HPVDNA检测在宫颈病变临床诊断及大规模筛查中有重要价值。

外周血sHLA-G与PGR、GPR联合检测在胃癌诊断中的效能评估

目的检测血浆可溶性HLA-G（sHLA-G）及胃蛋白酶原PGI、PGII胃泌素-17（G-17）在胃癌及相关胃病患者外周血中的表达水平，评估sHLA-G与PGR（PGI／PGII）、GPR（G-17／PGI）联合检测在胃癌诊断中的效能。方珐采用化学发光微粒子免疫分析技术检测50例健康对照组、46例萎缩性胃炎组、50例胃上皮内瘤变组、36例早期胃癌组及74例进展期胃癌组PGI、PGII的表达，同时采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测G-17、sHLA-G的表达水平，通过Logistic回归将各标志物引入方程，构建胃癌诊断模型，利用ROC曲线评估其在胃癌诊断中的效能。结果与健康对照组、萎缩性胃炎组和胃上皮内瘤变组比较，早期胃癌和进展期胃癌组的PGR较低（P〈0．05），而GPR与sHLA-G较高（P〈0．05）；sHLA-G与PGR诊断胃癌的ROC曲线下面积（AUC）分别为0．846（95％CI，0．760～0．910）和0．835（95％a，0．748～0．902），均高于GPR的AuC0．716（95％CI，0．617～0．802，P〈0．05）；构建联合检测胃癌诊断模型的方程为logit（Y）=0．41＋0．03×sHLA-G-5．90×PGR，得到新变量Y诊断胃癌的AUC为0．924（95％a，0．873～0．967），高于sHLA-G和PGR（P〈0．05）。结论sHLA-G和PGR联合检测对胃癌具有较高的诊断价值，可作为传统肿瘤标志物的有益补充。

新鲜全血在不同血细胞分析仪比对试验中的评价

目的验证不同血细胞分析仪检测结果之间的可靠性和可比性,规范操作血细胞分析仪的比对试验。方法参照国际血液学标准化委员会(ICSH)及美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)文件,在仪器正常运行的情况下,评价各比对仪器的携带污染率、精密度和总精密度、差异百分率;分析比较20份抗凝新鲜全血中各项指标在不同血细胞分析仪之间的差异;每日取高、中、低3份新鲜血,在各仪器上平行检测,连续比对7日,观察各项指标与参考样机之间的相关性;分析比较仪器分类与手工分类的相关性;通过直线回归方程计算相对偏差,估计每台仪器各检测指标的试验误差。结果除白细胞分类外,各比对仪器携带污染率正常;各检测指标的变异系数以及在不同血细胞分析仪上的总体变异系数均<5%;各检测项目的差异百分率符合ICSH制定的标准;20份样品在不同血细胞分析仪上检测的各项指标经两两比较的q检验(Newman-Keuls法),各配伍组总体均数无统计学差异(P>0.05);连续7日测得的各项指标与参考样机之间的相关系数均大于0.97,其相对偏差在实验允许误差范围内。白细胞分类中,中性粒细胞和淋巴细胞在各比对仪器之间以及仪器与手工分类之间的相关性较好,而嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞和单核细胞,不论在各仪器还是仪器与手工分类之间,都存在较大的试验误差(P<0.05,P<0.01)。结论不同血细胞分析仪检测结果之间的比对试验急需规范化,同一科室的多台血细胞分析仪应定期进行比对,以保证检验结果的准确性。

MiR-182在结直肠癌中的表达及其对结直肠癌细胞迁移能力的影响

目的检测miR-182在结直肠癌中的表达情况及与临床病理参数的关系,探讨其对结直肠癌细胞迁移能力的影响。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测86例患者结直肠癌与对应癌旁组织中miR-182的表达情况,分析其与结直肠癌临床病理参数之间的关系。体外用miR-182 mimics和阴性对照转染结直肠癌HT-29细胞,将实验分为miR-182组、阴性对照组和空白组,transwell小室实验观察miR-182对HT-29细胞迁移能力的影响。结果 MiR-182在结直肠癌的表达显著高于癌旁(P<0.001),其表达水平与患者的浸润程度(P=0.028)、淋巴结转移(P=0.003)、远处转移(P=0.006)和临床分期(P=0.005)密切相关,而与年龄、性别、肿瘤类型、肿瘤大小和分化程度无相关性(P均>0.05)。体外实验进一步表明,miR-182过表达的HT-29细胞迁移数显著高于阴性对照组和空白组(P均<0.05)。结论 MiR-182在结直肠癌中高表达且与肿瘤的转移及进展有关,体外能增强结直肠癌细胞的迁移能力,提示miR-182可作为预防和治疗结直肠癌转移的潜在靶点。

山东地区宫颈癌危险因素病例对照研究

目的探讨山东地区宫颈癌发病危险因素。方法采用以医院为基础的1:2病例对照研究,用统一的调查表对山东省三所省级医院893例宫颈癌患者及1786例对照进行调查,应用条件Logistic回归分析筛选宫颈癌发病危险因素。结果在单因素Logistic回归分析的基础上,HPV16感染、HPV52感染、吸烟、首次性交年龄、性伴侣个数、人工流产次数、配偶有阴茎癌或前列腺癌、绝经和使用避孕套共9个因素被引入回归模型,其OR值依次为:28.256、10.164、2.946、4.529、4.012、4.211、1.312、0.507和0.612。结论HPV16、HPV52感染是山东地区宫颈癌发生的主要危险因素,首次性交年龄早、性伴侣个数多、人工流产次数多、吸烟以及配偶有阴茎癌或前列腺癌可增加宫颈癌发生的危险,而绝经和使用避孕套则降低宫颈癌的发生风险。

膀胱癌患者血清microRNA检测中内参基因的筛选及验证

目的筛选并验证适用于膀胱癌患者血清microRNA(miRNA)定量检测的内参基因。方法选取100例肌层浸润性膀胱癌患者、105例非肌层浸润性膀胱癌患者及139例健康对照者血清,通过Miseq测序筛选出表达较为稳定的miRNA,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测上述筛选出的miRNA及U6表达水平,利用geNorm及NormFinder软件对其稳定性进行分析,并在新的实验组中对软件所推荐内参基因及组合进行验证,选取miR-148b-3p作为靶分子,以进一步分析所选择内参基因的可靠性。结果采用qRT-PCR法对M iseq测序结果进行验证,筛选出hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-16-5p、U6、hsa-miR-191-5p和hsa-let-7d-3p作为候选内参基因,经分析和验证后证实,hsa-miR-193a-5p作为内参基因最稳定,hsa-miR-193a-5p和hsa-miR-16-5p的组合为最佳内参组合。同时,miR-148b-3p在膀胱癌患者血清中明显上调并具有一定的诊断价值。结论在对膀胱癌血清miRNA检测时,hsa-miR-193a-5p为最稳定内参基因,hsa-miR-193a-5p和hsa-miR-16-5p为最佳组合,联合应用可使结果更为准确可靠。

血清循环 Bmi-1 mRNA 检测方法的建立及其在结直肠癌诊断中的应用

目的：建立一种血清循环B细胞特异性莫洛尼白血病毒插入位点1（ Bmi-1）信使核糖核酸（mRNA）直接逆转录-实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR-D）检测方法，并运用该方法对结直肠癌血清循环Bmi-1 mRNA水平进行分析，探讨其在结直肠癌诊断中的价值。方法方法学建立。提取结直肠癌HT29细胞株RNA，建立Bmi-1、泛素C （ UBC）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ GAPDH） mRNAs检测标准曲线，计算扩增效率。利用RT-qPCR-D方法对血清、准备液混合液中Bmi-1 mRNA进行直接检测，通过熔解曲线评价试验的特异性，以及血清样本稀释观察方法的检测下限。并且，用该方法检测2008年1月至2009年1月山东大学齐鲁医院158例结直肠癌患者，其中Ⅰ期26例、Ⅱ期53例、Ⅲ期47例和Ⅳ期32例，以及53例结直肠镜检查正常者血清循环Bmi-1 mRNA水平，采用Kruskal-Wallis H、Mann-Whitney U检验比较各组Bmi-1 mRNA表达水平，受试者工作特征曲线（ ROC）分析其对结直肠癌的检测效能。结果 Bmi-1、UBC、GAPDH log值与定量循环（ Cq ）值间呈良好线性关系（R2＝0.990、0.990、0.99，P均＜0.001），扩增效率（E）分别为0.875、0.917、0.935。建立的RT-qPCR-D方法，检测Bmi-1、UBC、GAPDH mRNAs的熔解曲线峰值单一；检测下限可达1.25μl。运用该方法检测血清循环Bmi-1 mRNA水平，在结直肠癌Ⅰ期患者中为0.138（0.078-0.228），Ⅱ期患者中为0.163（0.067-0.287）、Ⅲ期患者中为0.217（0.072-0.267）、Ⅳ期患者中为0.273（0.139-0.419）以及对照者中为0.021（0.008-0.029），各组间比较差异有统计学意义（H＝89.5，P＜0.001）。结直肠癌各期组循环Bmi-1 mRNA水平明显高于对照组（U＝58.0、287、246、72.5，P均＜0.001）；循环Bmi-1 mRNA在Ⅳ期患者中的水平明显高于其他各期患者（U＝247、590、540，P＝0.008、0.020、0.035），而在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者间比较，差异无统计学意义（U＝633、514、1170，P均＞0.05）。血清循环Bmi-1 mRNA水平检测结直肠癌的ROC曲线下面积（AUC）为0.921（95％CI＝0.876-0.953），明显优于癌胚抗原（CEA）（0.745，95％CI＝0.680-0.802，Z＝4.697，P＜0.001）。其检测结直肠癌的最佳临界值为0.034时，敏感度为89.2％（141/158），特异度为90.6％（48/53）。而血清CEA诊断结直肠癌的敏感度和特异度只有41.8％（66/158）和73.6％（39/53）。血清循环Bmi-1 mRNA和CEA两项指标进行联合检测，发现其检测结直肠癌的AUC为0.933（95％CI＝0.890-0.963），与循环Bmi-1 mRNA AUC比较，差异无统计学意义（Z＝4.697，P＞0.05）。结论本实验建立的血清循环Bmi-1 mRNA检测方法具有较高的特异度和敏感度，利用该方法发现血清循环Bmi-1 mRNA水平在结直肠癌患者中明显升高，并且对结直肠癌的检测效能优于传统肿瘤标志物CEA，其可能成为一项潜在的检测指标，为结直肠癌的早期发现提供帮助。（中华检验医学杂志，2014，37：678-682）

特异性siRNA抑制HPV16 E7基因表达的实验研究

目的筛选针对HPV16 E7基因有效的siRNA,探讨其对HaCaT-E7细胞中HPV16 E7 mRNA及细胞表面HLA-Ⅰ类分子表达的影响。方法采用化学法合成3条HPV16 E7特异性siRNA,应用转染试剂Lipofectamine2000将其转染入HaCaT-E7细胞,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测HPV16 E7 mRNA的表达,采用流式细胞术(FCM)检测细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达。结果3条siRNA均能有效抑制HaCaT-E7细胞中HPV16 E7的转录表达,以siR-NA2作用效果最明显,抑制率达75%,细胞膜表面HLA-Ⅰ类分子的表达明显上调,平均荧光强度(MFI)为130.18±1.07,高于空转染对照组(100.32±3.01)和非特异性siRNA对照组(100.82±2.87)。结论化学合成的HPV16 E7特异性siRNA能有效抑制HaCaT-E7细胞中E7 mRNA的表达,同时使细胞表面HLA-Ⅰ类分子表达上调。

实时荧光定量PCR测定人乳头状瘤病毒16型E7基因方法学的建立及其在宫颈疾病诊断中的应用价值

宫颈癌是世界妇女第2高发肿瘤，每年新发病例493000人，并导致274000人死亡。高危型人乳头状瘤病毒（HPV），尤其是HPV16型，在宫颈癌发生、发展进程中起关键作用。病毒早期，E7基因是导致宫颈上皮细胞恶性转化和永生化的重要因素，其编码的E7蛋白通过与pRb结合，干扰细胞周期调控及DNA修复，从而使细胞不稳定性增加。