近交系五指山小型猪脂肪间充质干细胞分离培养及生物学特性

目的:建立近交系五指山小型猪(inbreed line miniature pig of Wuzhishan,ILMW)脂肪间充质干细胞(adiposederived mesenchymal stem cells,ASCs)体外分离培养和鉴定方法。方法:选取6月龄健康ILMW 3头,从颈部皮下无菌获取脂肪组织约100 g,采用0.1%I型胶原酶消化组织,获得ILMW-ASCs,并进行体外培养和增殖;取第3,5,8,13代细胞进行如下实验:测量细胞大小,观察细胞形态,检测细胞表型、细胞周期、细胞凋亡,并进行细胞诱导分化和绘制细胞增殖曲线。结果:体外分离培养的ILMW-ASCs在体外贴壁,呈成纤维样或旋涡状生长;原代细胞培养36 h出现贴壁,第5天进入对数增殖期,约7 d后80%的细胞汇合。ILMW-ASCs细胞直径及体积分别为(17.00±0.54)μm和(2.58±0.24)×10–9 L。细胞表面抗原CD29,CD44和CD90呈高表达,不同代数之间的差异不明显(均P>0.05);CD45,CD8a和HLA-DR呈低表达,与第3代相比,随着代数的增加细胞表面抗原的阳性率逐渐增高(均P<0.05)。ILMW-ASCs成脂诱导结果为油红O染色呈阳性;ILMW-ASCs成骨诱导结果为茜素红染色呈阳性。ILMW-ASCs的第13代细胞出现凋亡和衰老,与较低培养代数相比细胞周期S期的比例下降(均P<0.05)。结论:ILMW-ASCs取材方便,贴壁时间早,细胞增殖活跃,传代周期短,传代后能保持稳定的生物学特性,是猪来源ASCs的最佳选择之一,可为大动物疾病模型和组织器官修复的细胞治疗提供候选干细胞来源。

脂肪间充质干细胞的研究进展

过去,脂肪只被看作是一种能量储存的组织而未引起研究者们重视。直到20世纪80年代中期,确定其参与性激素的新陈代谢后,脂肪组织变成一个参与人体新陈代谢和免疫应答重要的内分泌器官[1]。2001年Zuk等[2]首次报道一种新成体干细胞的来源。

2型糖尿病合并H型高血压的研究进展

2型糖尿病合并H型高血压是临床常见疾病,其影响因素有遗传、营养等,可引起心血管疾病、肾脏疾病、眼部疾病、神经系统疾病等多种疾病,合理降糖降压并控制同型半胱氨酸水平是预防和治疗的有效措施。

低强度脉冲场超声促进人脂肪间充质干细胞的增殖和黏附

背景:间充质干细胞是目前组织工程和再生医学研究的热点之一,然而如何在体外进行干细胞的有效扩增以满足临床需求仍是研究者们面临的难题。目的:探讨低强度脉冲场超声对人脂肪间充质干细胞增殖和黏附的影响。方法:取第3代人脂肪间充质干细胞,在人脂肪间充质干细胞培养24,48,72 h时以0,10,30,50 mW/cm~2低强度脉冲场超声强度进行第1,2,3次刺激,每次刺激时间为5 min,刺激结束后将细胞置于培养箱继续培养24 h,然后采用CCK-8实验筛选最佳刺激条件。选用30 mW/cm~2强度刺激2次后的细胞为实验组进行后续实验,0 mW/cm~2刺激为对照组。流式细胞仪术检测细胞表面标志物;免疫组化染色观察细胞增殖相关抗原Ki-67和黏着斑激酶FAK的表达;RT-PCR检测细胞增殖通路相关基因Cyclin D1和c-myc的表达;转录组测序检测转录水平基因的变化。结果与结论:①30 mW/cm~2强度连续刺激2次是促进人脂肪间充质干细胞增殖的最佳条件;②与对照组相比,30 mW/cm~2低强度脉冲场超声刺激后细胞表面标志物未改变,增殖相关基因CyclinD1、c-myc和黏着斑激酶FAK表达上调;③转录组测序结果显示有27个基因出现显著性差异,其中15个基因上调,12个基因下调;④结果表明,低强度脉冲场超声通过上调CyclinD1、c-myc基因和FAK的表达,伴随转录组多个基因的调控,在细胞未分化的状态下,促进人脂肪间充质干细胞增殖。

低强度脉冲超声增强人外周血淋巴细胞增殖及抗癌活性的实验研究

目的探讨低强度脉冲超声(LIPUS)对人外周血淋巴细胞(HPBL)增殖和抗肿瘤效应的影响。方法采用Ficoll梯度离心法分离HPBL;将LIUPS强度0设为对照组,10 mW/cm^2组、20 mW/cm^2组、30 mW/cm^2组、40 mW/cm^2组、50 mW/cm^2组为刺激组刺激HPBL增殖,每天一次,每次刺激10 min,连续刺激2 d。CCK-8法检测各组细胞增殖活性;酶联免疫吸附法检测抗肿瘤因子[γ干扰素(INF-γ)、白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)]表达情况;采用共培养HPBL与人肺巨细胞癌95D细胞检测其抗肿瘤活性。结果 LIPUS刺激HPBL2 d共2次后,30 mW/cm^2组的细胞增殖能力增强,与对照组和其他强度刺激组比较,细胞数量和细胞团块数量均增多。CCK-8检测结果显示,30 mW/cm^2组光密度值与对照组、20 mW/cm^2组、40 mW/cm^2组、50 mW/cm^2组比较差异均有统计学意义(P=0.032、0.027、0.027、0.001)。抗肿瘤因子检测显示,30 mW/cm^2组INF-γ、IL-2、TNF-α和GM-CSF分别为(39.66±8.30)ng/L、(619.84±125.94)ρg/ml、(461.29±14.08)ng/L、(108.11±2.07)ng/L,均高于对照组[(24.40±6.84)ng/L、(279.56±128.18)ρg/ml、(417.17±21.44)ng/L和(96.53±1.56)ng/L]和50 mW/cm^2组[(16.52±0.87)ng/L、(141.00±93.71)ρg/ml、(171.96±9.46)ng/L、(72.56±8.95)ng/L],差异均有统计学意义(均P<0.01)。共培养实验显示,30 mW/cm^2组人肺巨细胞癌95D细胞杀伤率为51.11%±5.21%,显著高于对照组(42.86%±0.55%)和50 mW/cm^2组(42.00%±3.67%),差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 LIPUS刺激可提高HPBL的增殖活性和杀伤率。

人脂肪间充质干细胞体外高效扩增新方法

目的运用低强度脉冲场超声(LIPUS)刺激促进人脂肪间充质干细胞(hASCs)增殖,为临床干细胞体外高效增殖提供新方法。方法通过LIPUS体外刺激hASCs细胞生长,采用Scepter 2.0手持细胞计数器进行细胞计数,运用荧光倒置显微镜观察细胞形态,运用流式细胞仪检测细胞表面标志物,并进行干细胞临床前质量检测。结果刺激组50 mW/cm^2和60 mW/cm^2的LIPUS刺激强度均能促进细胞增殖,60 mW/cm^2强度更显著,与对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05);细胞倍增时间比对照组缩短,差异具有统计学意义(P<0.05),刺激后刺激组细胞表面标志物无变化,增殖后干细胞质量检测符合标准要求。结论 LIPUS刺激可促进hASCs有效增殖,低强度脉冲场超声可作为干细胞体外扩增的新方法。

两种月龄近交系五指山小型猪脂肪间充质干细胞生物学特性的比较

背景:干细胞是再生医学研究的热点,影响干细胞生物学特性的因素很多,其中供体年龄是重要的影响因素之一。目的:观察两种月龄近交系五指山小型猪脂肪间充质干细胞生物学特性的变化,筛选最佳种子细胞来源。方法:以4月龄和12月龄近交系五指山小型猪脂肪间充质干细胞为研究对象,分别选取第3代细胞和第10代细胞,观察细胞形态,绘制细胞增殖曲线,检测细胞表面抗原、细胞周期、细胞凋亡情况,然后进行成骨诱导分化茜素红染色和成脂诱导分化油红O染色以及细胞衰老β-半乳糖苷酶染色等。结果与结论:①4月龄和12月龄细胞均呈漩涡状贴壁生长,表面标志物CD29、CD44和CD90表达均为阳性,CD8a、CD45和HLA-DR表达均为阴性;②4月龄和12月龄第3代细胞增殖能力均较强;第10代细胞,与4月龄相比,12月龄G0/G1期百分比增高(P<0.001),早期凋亡增加(P<0.001),而S期和G2/M期百分比显著下降(P<0.001);③4月龄和12月龄第3代细胞的体外诱导分化能力无显著性差异;12月龄第10代细胞的钙化结节率和脂滴率与4月龄相比显著降低(P<0.001);④4月龄和12月龄第3代细胞β-半乳糖苷酶几乎不表达;12月龄第10代细胞β-半乳糖苷酶阳性细胞与4月龄相比显著增加(P<0.001),且细胞形态变得更加扁平和肥大、折光性弱;⑤结果表明,4月龄近交系五指山小型猪脂肪间充质干细胞具有更强的增殖和分化能力,且细胞衰老活性更低,提示4月龄更适合用于自体移植的种子细胞。

双标细胞因子诱导的杀伤性细胞系构建

目的构建表达荧光素酶(Luc)及绿色荧光蛋白(GFP)双标细胞因子诱导的杀伤性(CIK)细胞系。方法体外原代培养C57BL/6小鼠CIK细胞,使用构建好的表达Luc及GFP的慢病毒载体包装重组慢病毒,感染培养第14天的CIK细胞,嘌呤霉素筛选2 w后,采用荧光倒置显微镜观察GFP表达情况,PCR、基因测序及体外活体成像系统对感染后的CIK细胞表达Luc进行验证。结果Luc-GFP-CIK双标细胞系构建成功,能够稳定表达Luc及GFP。荧光倒置显微镜观察显示转染后CIK细胞形态正常且表达GFP;PCR和测序结果显示转染后CIK细胞获得Luc基因;体外活体成像系统检测显示转染后CIK细胞表达Luc。结论初步构建了简便、安全的双标CIK细胞系,该方法便于普及,可为CIK细胞在体内的进一步研究提供前期基础和实验工具。

联合免疫抑制和放疗治疗甲状腺眼病的临床效果观察

目的:探讨联合免疫抑制和放疗治疗甲状腺眼病(TAO)的临床效果。方法:选择2015年1月~2018年3月于我院就诊的94例中重度TAO患者作为研究对象,采用随机数字表法结合患者意愿将患者分为免疫组(n=47例)和联合组(n=47例)。免疫组给予甲泼尼龙联合环磷酰胺冲击疗法,联合组在免疫组的基础上给予放射治疗。观察2组入组时、第4周及第24周时突眼度、眼睑裂宽度和甲状腺体积,比较两组患者治疗前、治疗24周免疫功能,评价临床治疗效果、相关不良反应发生率。结果:第24周2组时突眼度、睑裂高度、甲状腺体积、CAS评分、视力与治疗前相比较均显著降低(P<0.05)。2组第4周时突眼度、睑裂高度、甲状腺体积、CAS评分、视力相比较差异均无统计学意义(P>0.05);联合组第24周时突眼度、睑裂高度、CAS评分低于免疫组,视力水平高于免疫组,差异有统计学意义(P<0.05),2组第24周时甲状腺体积相比较差异无统计学意义(P>0.05)。联合组临床有效率高于免疫组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组治疗前CD3^+、CD4^+、CD8^+及CD4^+/CD8^+水平比较差异均无统计学意义(P>0.05);治疗24周,免疫组CD3^+、CD4^+、CD8^+及CD4^+/CD8^+显著低于治疗前,且低于联合组治疗24周,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者治疗24周期间恶心呕吐、皮疹、头晕、肝功损伤、肾功损伤发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:免疫抑制联合放疗可增加TAO的临床疗效,值得进一步研究探讨。

Klotho基因G-395A位点多态性与糖尿病肾病的关系

目的探讨Klotho基因G-395A位点多态性与糖尿病肾病的关系。方法选取单纯2型糖尿病患者147例(单纯糖尿病组)、糖尿病肾病患者98例(糖尿病肾病组)、健康志愿者100例(健康组),采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测各组Klotho基因G-395A位点多态性,采用多因素Logistic回归分析法分析糖尿病肾病发病的危险因素。结果经实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测,Klotho基因G-395A位点出现了AA、GA、GG三种基因型。健康组与单纯糖尿病组AA基因型分布明显低于糖尿病肾病组,GA基因型+GG基因型分布明显高于糖尿病肾病组(P均<0. 05);健康组与单纯糖尿病组AA基因型、GA基因型+GG基因型分布比较P均>0. 05。健康组与单纯糖尿病组A等位基因频数明显低于糖尿病肾病组,G等位基因频数明显高于糖尿病肾病组(P均<0. 05);健康组与单纯糖尿病组组A、G等位基因频数比较P均>0. 05。多因素Logistic回归分析显示,Klotho基因G-395A位点AA基因型分布增加是糖尿病肾病发病的危险因素(OR=2. 026,95%CI:0. 902~4. 552,P=0. 087)。结论 Klotho基因G-395A位点多态性与糖尿病肾病发病有关,该位点AA基因型分布增加可能是糖尿病肾病发病的独立危险因素。

活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶在系统性红斑狼疮患者肾组织中的表达及临床意义

目的探讨活化诱导的胞嘧啶核苷脱氨酶(AICDA)在系统性红斑狼疮(SLE)患者肾组织中的表达及临床意义。方法收集2013年3月至2017年6月于中南大学湘雅医学院附属海口医院就诊的73例SLE患者和36例原发性膜性肾病(Ⅱ期)患者(对照组)肾穿刺活组织检查的肾组织,利用免疫组织化学染色方法检测肾组织中AICDA的表达水平。分析AICDA的表达与SLE患者临床病理参数(病理分型、系统受累情况、疾病活动度评分、治疗转归)的关系。结果 SLE患者肾组织中AICDA的表达水平高于原发性膜性肾病患者,差异有统计学意义(6.12±2.47 vs 3.33±1.91,P<0.05)。Ⅲ型(5.25±4.06)、Ⅳ型(6.88±2.20)、Ⅴ型(6.10±1.66)、Ⅲ+Ⅴ型(5.75±2.34)、Ⅳ+Ⅴ型(5.72±2.37)狼疮性肾炎患者间AICDA的表达水平差异无统计学意义(P均>0.05)。有口腔溃疡、间质性肺炎、神经系统损害、关节炎、血液系统损害和浆膜炎SLE患者肾组织中AICDA的表达水平分别高于无上述系统损害者(7.02±2.14 vs 4.17±1.97,7.86±2.39 vs 4.98±1.76,9.83±1.34 vs 5.39±1.92,6.88±2.04 vs 2.93±1.21,7.51±1.81 vs 3.70±1.23,7.29±2.33 vs 5.34±2.29;P均<0.01)。SLE疾病活动度评分越高,AICDA的表达越强,组间差异有统计学意义(P<0.01)。SLE完全缓解患者肾组织中AICDA表达低于未完全缓解患者,但差异无统计学意义(5.84±2.39 vs 6.80±2.56,P>0.05)。结论 AICDA与SLE的发生和发展有关,有望为SLE的治疗带来新的靶点。

甲基强的松龙免疫抑制在活动期甲状腺相关眼病治疗中的作用

目的:探讨甲基强的松龙免疫抑制在活动期甲状腺眼相关病(TAO)治疗中的作用。方法:选择2015年8月至2017年12月在我院就诊的34例活动期中重度TAO患者作为研究对象,所有患者给予静脉甲基强的松龙冲击疗法。观察患者在输液前(T0)、输液时(T1)、输液结束时(T2)和输液结束30 min(T3)均时的心率、收缩压、动脉压,观察患者每次治疗前后血钾、血糖、炎症因子、体质量及血脂水平,观察患者的症状改善率、甲状腺功能及临床疗效。结果:患者治疗后畏光、流泪、异物感等临床症状体征均显著改善。患者治疗前CAS评分为(4.5±0.8)分,治疗后CAS评分为(1.6±0.9)分,差异有统计学意义(P<0.05),34例患者的治疗有效率为82.35%。患者T1、T2时收缩压、舒张压、心率与T0时相比较均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);T3时收缩压低于T0,但差异无统计学意义(P>0.05);T3时患者舒张压、心率均低于T0,差异有统计学意义(P<0.05)。患者治疗后TSH水平显著高于治疗前,FT3、FT4水平显著低于治疗前,差异均有统计学意义(P<0.05)。患者治疗后血糖水平显著高于治疗前,血钾离子、CRP、TNF-α、IL-6水平显著低于治疗前,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:静脉甲基强的松龙冲击疗法治疗中重度TAO安全有效,对心率和血压具有轻微和非累积的效应,对血糖、血钾、炎症因子、甲状腺功能有明显影响,临床应用过程中应做好针对性监测。

慢性乙型肝炎患者血清IFN-γ、TNF-α与HBV DNA关系研究

目的通过慢性乙型肝炎(CHB)患者不同临床过程中γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)与丙氨酸转移酶(ALT)和HBV DNA水平相关性研究,探讨IFN-γ和TNF-α对乙型肝炎病毒(HBV)复制影响。方法选取慢性乙型肝炎急性发作患者30例(急性发作组)、慢性乙型肝炎需要抗病毒治疗患者30例(慢性乙型肝炎组)、慢性乙型肝炎免疫耐受患者20例(免疫耐受组),急性发作组和慢性乙型肝炎组接受恩替卡韦或替诺福韦酯治疗。采集基线时血清肝功能、HBV DNA、HBe Ag、抗-HBe、肌酐、肌酸激酶、IFN-γ、TNF-α水平和肝脏超声检查,并在临床观察第12、24周进行随访评估。结果急性发作组基线ALT、天冬氨酸转移酶(AST)、总胆红素(TBil)、TNF-α、IFN-γ水平较高(P <0. 001),免疫耐受组基线HBV DNA水平较高(P <0. 05)。急性发作组ALT、HBV DNA、TNF-α、IFN-γ水平经核苷类似物(NAs)治疗后明显下降(P <0. 05);慢性乙型肝炎组ALT、HBV DNA、TNF-α水平经NAs治疗后明显下降(P <0. 05),IFN-γ水平经NAs治疗后变化差异无统计学意义(P> 0. 05);免疫耐受组ALT、HBV DNA、IFN-γ、TNF-α水平在观察期间变化差异无统计学意义(P>0. 05)。急性发作组TNF-α、IFN-γ水平与ALT水平具有正相关性(P <0. 001),TNF-α、IFN-γ水平与HBV DNA水平具有正相关性(P <0. 001)。结论慢性乙型肝炎急性发作患者TNF-α、IFN-γ与HBV DNA水平具有正相关性,TNF-α、IFN-γ与HBV复制关系密切。

微小RNA-130b靶向调控PTEN表达及对骨肉瘤细胞上皮间质转化的影响

目的探讨微小RNA-130b(miR-130b)对第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)的靶向调控及骨肉瘤(OS)MG-63细胞上皮间质转化(EMT)的影响。方法从美国国家生物技术信息中心的GEO数据库中下载基因表达谱OS样本数据集GSE39058、GSE79181的series matrix数据分别用于分析OS组织的miR-130b水平及与预后的关系。采用脂质体法将miR-130b抑制剂转染至MG-63(抑制组),同时设置未转染组和空白对照组,活细胞计数CCK-8和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测增殖活力和凋亡率,实时定量PCR和Western blotting检测PTEN及上皮表型标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和间质表型标志物波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的水平,在线预测miR-130b与PTEN的靶向结合序列并利用双荧光素酶报告基因实验验证两者的靶向关系。结果GSE39058数据集显示,65例OS患者的组织miR-130b水平为11.040±1.008,高于26例化疗后切除组织的9.614±1.154(P<0.05);GSE79181数据集显示,miR-130b低水平组的中位生存期为2823天,优于高水平组的1463天(P<0.05)。抑制组的miR-130b水平为0.038±0.006,低于未转染组的1.160±0.137和空白对照组的1.049±0.089;抑制组的凋亡率为(17.672±1.664)%,高于未转染组的(7.975±0.364)%和空白对照组的(7.438±0.560)%,差异有统计学意义(P<0.05)。抑制组转染24、48 h后的细胞活力较未转染组和空白对照组减弱(P<0.05);与未转染组和空白对照组相比,抑制组的Vimentin和α-SMA水平降低,而PTEN和E-cadherin水平升高(P<0.05)。未转染组和空白对照组上述指标的差异无统计学意义(P>0.05)。双荧光素酶活性检测结果显示,miR-130b模拟物与PTEN野生型质粒共转染细胞后,荧光素酶活性降低(P<0.05),而与PTEN突变型质粒共转染后的荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。结论OS组织中miR-130b水平升高且下调miR-130b水平可抑制细胞增殖和EMT过程并诱导凋亡,可能通过靶向PTEN来发挥促癌作用,在OS靶向治疗中有一定价值。

应用双向电泳和免疫印迹技术分析软叶针葵花粉变应原

目的：采用双向电泳和免疫印迹技术对软叶针葵花粉提取液蛋白质组分进行分析,寻找软叶针葵花粉的主要变应原。方法：提取软叶针葵花粉变应原,应用双向电泳（2-DE）结合免疫印迹技术,获得相应的电泳图谱和免疫印迹图谱。结果：软叶针葵花粉蛋白提取液经双向电泳后,用考马斯亮蓝染色,得到的电泳图显示约有601个主要蛋白斑点。分子量（Mr）分布约20～130kD;等电点（pI）主要集中在4.0～8.0。免疫印迹分析结果显示,阳性组与对照组的差异蛋白点数约为19个。结论：双向电泳联合免疫印迹技术对软叶针葵花粉提取液蛋白质组分分析,可寻找到其主要变应原,并可进一步用于变应原致敏组分的研究。