水稻齿叶矮缩病毒的研究进展

水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged stunt virus,RRSV)属呼肠孤病毒科水稻病毒属,其所致的水稻齿叶矮缩病是东南亚、东亚和南亚一些国家的重要病害,病害的发生对当地的水稻生产造成严重影响。综述了国内外有关RRSV的生物学、分子生物学方面的研究进展及其所致病害的控制策略。

病毒诱导基因沉默的研究进展

对病毒诱导的基因沉默(VIGS)的发现、载体的开发、作用机理和优势的研究,以及VIGS在植物基因功能鉴定上的应用和展望进行了综述.

孔石莼凝集素蛋白基因的克隆与表达

根据孔石莼(Ulva pertusa)凝集素(Lectin)蛋白cDNA全长序列(GenBank登录号:AY433960)设计引物,以其总DNA为模板,采用PCR技术扩增蛋白DNA序列,经克隆、测序获得基因序列。结果表明,孔石莼凝集素蛋白(UPL)基因序列长约为670 bp,含有一个大小为56 bp的内含子。此外,设计带酶切位点的引物,以UPL-cDNA为模板,扩增其开放阅读框,并与表达载体pGEX-2T连接,构建原核表达载体pG2T-UPL,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达大小约为47 kD的目的蛋白。

水稻条纹病毒编码的NS2蛋白的亚细胞定位分析

通过RT-PCR克隆获得水稻条纹病毒(RSV)编码的蛋白NS2和拟南芥柯浩体蛋白Atcoilin的cDNA,将两者分别与表达载体pEarley102(带青色荧光蛋白,CFP)和pEarley101(带黄色荧光蛋白,YFP)同源重组.将构建好的重组载体分别转化到农杆菌EHA105中,通过农杆菌接种法将两者共同注射到本氏烟叶片表皮细胞中进行表达.在共聚焦显微镜下观察,NS2-CFP与Atcoilin-YFP能重叠在一起,表明RSV NS2定位于柯浩体.

1个Avr/Cf介导的差异表达基因在番茄抗叶霉病中作用的基因沉默分析

Avr/Cf介导产生过敏性反应时特异表达的cDNA-AFLP片段,称为ACE(Avr/Cf-elicited)片段,从中挑选1个未知功能的基因(记为ACE5)(GeneBank登录号为CK348288),利用VIGS技术对该片段相应基因进行基因沉默分析,分析该基因在植株生长和发育以及番茄抗叶霉病中的作用。结果表明该差异表达片段相应基因对本氏烟的生长发育以及Avr/Cf介导的HR反应均无影响。

生防菌EN5的定殖能力及其对根际土壤微生物类群的影响

[目的]明确生防菌EN5菌株在番茄根、茎及根际土壤中和在黄瓜、烟草体内的定殖情况,及对根际土壤微生态的影响,为细菌性青枯病的生态治理提供理论依据。[方法]采用抗生素抗性标记法测定生防芽胞杆菌EN5的定殖能力;以平板培养及ERIC-PCR法分析菌株EN5对番茄根际土壤微生物种群的影响。[结果]菌株EN5在番茄根、茎及根际土壤中均能稳定定殖,当菌株EN5处理植株15 d时,其在番茄茎内的定殖量可达5.6×104cfu/g;此外,菌株EN5在烟草和黄瓜体内亦可定殖,其在烟草体内的定殖量较大。菌株EN5处理使根际土壤中细菌、真菌和放线菌的数量明显高于对照土壤,对氨化细菌、固氮菌、纤维素降解菌等微生物群体有促进作用,对反硫化细菌群体有抑制作用。同时,菌株EN5处理还改善了根际土壤中细菌群体的多样性。[结论]菌株EN5可以在其自然寄主番茄的根、茎及根际土壤中稳定定殖。同时,菌株EN5处理有助于改善根际土壤微生态环境,抑制病菌繁殖。

短小芽孢杆菌EN16诱导番茄对细菌性青枯病的抗性

采用盆栽试验法研究了短小芽孢杆菌EN16对番茄青枯病的诱导抗病效应.结果表明,菌株EN16诱导番茄产生对青枯病的防病效果达到49.45%-68.89%;分别在挑战接种间隔期为7-10 d、菌株灌根接种2种处理条件下,菌株EN16表现出较好的诱导抗病效果.测定EN16处理对番茄叶片中几种防御酶的影响,结果显示,在病菌挑战接种前后菌株EN16处理均能引起过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等防御酶活性的显著增强.

柑桔黄龙病亚洲种病原(Candidatus Liberobacter asiaticus)16S rDNA的PCR-SSCP分析

应用PCR-SSCP技术对我国柑桔主要产区、泰国和法国留尼湾等地收集到的柑桔黄龙病亚洲种病原(Candidatus Liberobacter asiaticus)16S rDNA进行了分析。PCR结果表明,不同的地区的柑桔黄龙病亚洲种16S rDNA在长度上没有明显区别。进一步的SSCP结果显示,不同地区柑桔黄龙病亚洲种16S rDNA序列在组成上也没有差异。显示来自不同地区、不同寄主品种的柑桔黄龙病亚洲种种内没有存在明显差异。

丁香假单胞菌基因组内简单重复序列的比较分析

【目的】分析丁香假单胞菌3个致病变种基因组内简单重复序列(simple sequence repeats,SSR),为病菌SSR标记开发和遗传多样性研究提供有用信息。【方法】基于公共的基因组数据库资源,对3个菌株的完全重复SSR和不完全重复SSR的丰度和组成类型等进行分析。【结果】3个菌株完全重复SSR的分布规律较为相似,其中单碱基的短重复SSR均占绝对优势,多碱基和长重复SSR则较少;菌株B728a、1448A和DC3000的不完全重复SSR总数也较相近,分别为562、529和567,其中数量最多的均为六碱基重复。但3个菌株以四、五和六碱基为基序的SSR在基序组成和数量上则表现出较高的变异性,完全重复SSR中,除AGCC、ACCTGC等基序在两个菌株中同时出现,绝大多数基序仅在单个菌株基因组内出现;不完全重复SSR中,部分基序如CCCTG、ACGCA等的出现频率在不同菌株间存在明显差异。【结论】3个菌株的不完全重复SSR在数量和结构类型上均具有较大的相似性,而菌株间的完全重复SSR在数量和组成上则存在一定差异。

水稻条纹病毒NS2和NS3基因共干扰转基因水稻的培育及抗病性分析

NS2和NS3是水稻条纹病毒编码的两个转录后基因沉默抑制子,沉默抑制子往往与病毒致病性相关。本研究利用重叠PCR方法将NS2和NS3基因的部分cDNA片段重组后连接到RNAi载体,并借助PstⅠ将其重组到植物表达载体PXQ上;通过农杆菌介导法侵染水稻日本晴种子的愈伤组织,经新霉素（G418）抗性筛选获得31株转基因植株。对T0代转基因植株进行PCR及Southern blot分析结果显示,目的基因已成功转入水稻基因组中,并且不同转化植株含有目的基因的拷贝数不同;抗病性实验表明,与野生型植株相比,T0代转基因水稻能推迟RSV发病时间10~20d,导致病毒积累量下降30%~50%,且其下降量与发病时间延迟有相关性。

一个可指示核仁定位和柯浩体定位信号Marker的构建

通过RT-PCR获得本氏烟纤维蛋白Fibrillarin2的cDNA,并将其重组到表达载体pEarley101(黄色荧光蛋白,YFP)和pEarley102(青色荧光蛋白,CFP)上。在本氏烟叶片表皮细胞中瞬时表达融合蛋白,激光共聚焦显微镜下观察,发现蛋白定位在细胞核仁和柯浩体上,可以作为这两种细胞器的指示Marker,并通过Western blot检测融合蛋白的表达。该Marker对明确蛋白特别是病毒编码的蛋白在细胞核中的定位以及功能推测具有重要意义。

拮抗菌SB1的鉴定及其抗菌物质的分析

对番茄根系菌株SB1的抗菌活性进行测定,结果表明该菌株对多种植物病原真菌、细菌具有明显的抑制作用,表现出广谱抗菌活性。通过菌体形态、生理生化反应及16SrDNA序列分析,鉴定菌株SB1为枯草芽孢杆菌内生亚种。以青枯雷尔氏菌为指示菌,测定了菌株SB1抗菌物质的理化性质及组成。结果表明,其抗菌物质表现出良好的热稳定性、水溶性和醇溶性,且对紫外线照射和蛋白酶K处理不敏感。高效液相色谱分析结果进一步显示菌株SB1的抗菌物质中含有抗菌肽Surfactin。

GFP与水稻条纹病毒病害特异蛋白的融合基因在sf9昆虫细胞中的表达

用重叠延伸PCR（overlap Polymerase Chain Reaction，overlap-PCR）方法获得了含有绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）和水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）病害特异性蛋白SP（Disease-specific protein）两者的融合基因（GFP-SP），并将其克隆至载体pMD18-T，得到的重组质粒pMD18-T-GFP-SP经Xba Ⅰ／Hind Ⅲ双酶切后与经相同方法处理过的杆状病毒转移载体pFastBacHTb相连接构建成重组转移质粒pFastBacHTb-GFP-SP。酶切和测序鉴定证明了其序列的正确性并且无移码现象发生。将此质粒转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac，得到含有目的基因片段的重组杆状病毒穿梭质粒rb-GFP-SP。以之转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，sf9）细胞，24～48h后在显微镜200倍可见光视野下观察到被感染细胞发生了细胞和细胞核变大、细胞内颗粒物增多、细胞脱落甚至裂解等一系列与正常的st9昆虫细胞形态有明显区别的变化。荧光显微镜下可见部分细胞发出清晰的绿色荧光，且大部分荧光集中在细胞质部分。这些结果表明，GFP-SP融合蛋白在st9昆虫细胞内成功表达。

水稻条纹病毒p2与本氏烟柯浩体蛋白互作

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)编码的p2蛋白能与纤维蛋白互作并协助病毒系统运动。纤维蛋白定位在核仁和柯浩体上,作为柯浩体指示蛋白的coilin也参与病毒侵染过程。本文通过亚细胞共定位和双荧光互补实验证明p2与本氏烟柯浩体蛋白Nbcoilin互作;病毒诱导基因沉默技术瞬时沉默基因Nbcoilin后不影响植株的生长发育和水稻条纹病毒的侵染。所获结果表明,Nbcoilin虽然能与p2互作,但不影响水稻条纹病毒的侵染。

本氏烟柯浩体蛋白基因全长克隆及其功能预测

柯浩体蛋白coilin是细胞器柯浩体的重要指示蛋白,参与病毒侵染。本文根据拟南芥柯浩体蛋白(Atcoilin)在本氏烟基因组数据库中的比对结果,确定其对应的靶基因并设计引物,首次获得本氏烟柯浩体蛋白(Nbcoilin)基因全长序列3017 bp,编码区为2409 bp,编码803个氨基酸;具有柯浩体蛋白3个典型功能域以及一个类似动物柯浩体蛋白特有的精氨酸/甘氨酸富集区("RGG"box);系统发育树显示该蛋白归属植物coilin分支,亚细胞定位显示该蛋白定位在柯浩体上,确定该蛋白是coilin的同源蛋白。研究结果为探究Nbcoilin的功能及其与病毒互作奠定了基础。