幽门螺杆菌cgt基因表达量测定活菌的方法建立及应用研究

目的本研究旨在建立一种通过幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)cgt基因表达量来检测活菌的方法,以便为临床精准治疗开发快速、便捷的检测手段。方法通过培养法对活菌计数,并利用RT-qPCR方法测定相应H.pylori胆固醇-α-葡萄糖基转移酶(cholesterol-α-glucosyltransferase,CGT)保守编码基因cgt(hp0421)的mRNA表达水平,分析菌落数与cgt基因表达量之间的相关性,并构建回归方程;探索该方法可测定的线性范围、灵敏度和特异性。将此方法用于测定克拉霉素杀菌作用,验证其在细菌耐药检测中有效性。结果H.pylori菌落数为10^(2)、10^(4)、10^(6)、10^(8) CFU/mL的cgt的Ct值分别是29.67±0.14、23.37±0.36、17.65±0.37、11.38±0.39,在H.pylori菌落数为10^(1)~10^(8) CFU/mL范围内,RT-qPCR法测定的cgt基因表达量和活菌数对应的回归方程:y=-0.3501x+12.49,决定系数R2=0.9992、灵敏度为10^(1) CFU/mL,此方法与13种其他菌无交叉反应。用0、5、10、20、40μg/mL质量浓度的克拉霉素作用12 h后培养法测定H.pylori的活菌lg值分别为2.57±0.02、2.45±0.01、2.19±0.02、1.91±0.07、1.33±0.05,对应cgt基因的Ct值分别为27.76±0.09、28.37±0.24、29.51±0.14、30.11±0.12、31.66±0.11,将cgt基因表达量代入上述方程推算活菌数为2.73±0.03、2.52±0.08、2.11±0.05、1.89±0.02、1.33±0.04,经分析差异无统计学意义(P>0.05)。结论本研究成功建立了通过测定H.pylori的cgt基因表达量反映活菌的方法,有效缩短了检测周期,为临床活菌检测提供了新方法。