雷可肽生物合成中LxmX的表达纯化与结晶

雷可肽是一种对革兰氏阳性菌具有强抑制活性的第V类新型羊毛硫肽,其生物合成关键酶LxmX的蛋白晶体结构对雷可肽的生物合成机制解析至关重要。本研究构建了LxmX及其突变体LxmX’(S129/189M)的重组表达载体pPSUMO-lxmX和pPSUMO-lxmX’(S129/189M),并优化了表达条件,最终以Escherichia coli BL21(DE3)/pGro7为宿主,在0.1 mmol/L IPTG 30℃条件下诱导表达。通过镍柱亲和层析、TEV酶切、superdex200柱层析纯化得到纯度较高的蛋白。利用坐滴法点晶,20℃培养,经过结晶条件初筛和优化,得到了符合衍射条件的晶体。研究结果为解析LxmX的结构和研究雷可肽生物合成机制奠定了基础。

阿维菌素起始酰基转移酶的底物特异性

[背景]阿维菌素起始酰基转移酶(AveAT0)能够以2-甲基丁酰-辅酶A (coenzyme A,CoA)和异丁酰-CoA作为起始单元分别合成"a"系列或"b"系列的阿维菌素。[目的]探究AveAT0对两种底物的偏好性并进行改造。[方法]通过与识别不同底物的起始酰基转移酶(loading acyltransferases,AT0s)进行序列比对,找到AveAT0底物结合重要的氨基酸,利用活性位点定点突变的方法得到对底物偏好性改变的特定突变体。以2-甲基丁酰-CoA、异丁酰-CoA的类似物2-甲基丁酰-N-乙酰半胱氨(N-acetylcysteamine,SNAC)和异丁酰-SNAC为底物,用Ellman测试法检测释放SNAC的游离巯基(sulfhydryl,SH),测定AveAT0及其突变体的动力学常数,以此表征AveAT0及其突变体的底物偏好性。[结果]AveAT0对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.4 mmol/L,kcat值为14.1 min^-1,kcat/Km为32.1 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为6.4 min^-1,kcat/Km为7.5 L/(mmol·min)。选定的突变位点为V224M、Q149L、L121M。按顺序累积突变后发现三突变株AveAT0 V224M/Q149L/L121M对两个底物的偏好性区别最大,对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为5.4 min^-1,kcat/Km为6.9 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的kcat/Km为0.1 L/(mmol·min)。[结论]研究发现了AveAT0识别底物过程中的关键氨基酸,为改造阿维菌素聚酮合酶酰基转移酶提供了依据。

共价交联捕获聚酮合成中的酮基还原酶和酰基载体蛋白结构域的瞬时复合物

【背景】在模块化聚酮合成酶(polyketidesynthase,PKS)的催化过程中,催化结构域与同源酰基载体蛋白(acyl-carrierprotein,ACP)之间的蛋白质-蛋白质相互作用起重要作用,但这种瞬时可逆的相互作用难以捕捉分析。【目的】获得ACP和酮基还原酶(ketoreductase,KR)相互作用的蛋白复合物。【方法】在KR和ACP之间的Linker上插入烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶切位点,通过双功能马来酰亚胺试剂BMH将KR和ACP共价交联,随后TEV酶切检测交联结果。调整反应条件,使交联效率最大化。根据KR-ACP交联复合物与体系内其他蛋白标签和分子量的差异,通过亲和层析和凝胶过滤等纯化手段,获得纯度较高的KR-ACP稳定交联复合物。【结果】单独表达的KR和ACP结构域交联不成功,融合表达的KR+ACP双结构域可以有效交联,结合使用亲和层析和凝胶过滤等纯化手段成功获得纯度较高的复合物。该策略可运用于多个KR和ACP的共价交联。【结论】建立了捕获并纯化KR和ACP瞬时相互作用复合物的有效方法,为后期晶体结构的解析、KR与ACP相互作用机理的揭示及参与相互作用关键氨基酸的鉴定提供了实验基础。