猪δ冠状病毒胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种方便、快捷、实用的检测猪δ冠状病毒(PDCoV)方法,原核表达PDCoV N蛋白,以纯化的N蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤细胞技术研制2株分泌PDCoV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为E8、A10。2株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体敏感性及特异性良好,E8亚类为IgG2a,A10亚类为IgG1。以E8作为金标抗体、A10作为检测抗体、兔抗鼠作为质控线抗体制备PDCoV胶体金检测试纸条,检测PDCoV敏感性为100 TCID50,检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、PDCoV阴性对照均为阴性。本研究建立的胶体金试纸条检测方法敏感性及特异性良好,为PDCoV检测及流行病学调查奠定基础。

猪伪狂犬病病毒HB-11株的分离鉴定及gC基因的分析

将某猪场发病死亡猪的脑和肺组织接种BHK-21细胞,连传5代均出现典型细胞病变,表明分离到1株病毒,病毒含量为108. 33TCID50/mL。该毒株能被猪伪狂犬病病毒标准阳性血清中和,接种家兔、小鼠和仔猪均出现典型伪狂犬病症状,表明分离株为猪伪狂犬病病毒,命名为PRV HB-11株。gC基因的遗传进化分析显示,HB-11株与近年来流行的变异株同源性为99. 3%~99. 4%,与Bartha株的同源性为94. 8%,其gC基因序列相对于Bartha株序列有7个连续氨基酸的插入(158AAASTPA164),该突变插入的生物学意义有待于进一步研究。

犬瘟热病毒单克隆抗体的研制及胶体金试纸条检测方法的建立

利用原核表达、纯化的犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)N蛋白免疫BALB/c小鼠,成功筛选到两株分泌CDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为D3、D6。2株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体敏感性、特异性良好,能识别不同来源的CDV株,单抗亚类均为IgG1。以D3作为金标抗体,D6作为检测抗体,兔抗鼠IgG作为质控线抗体,制备CDV胶体金检测试纸条,检测CDV敏感性为1000 TCID50,能在CDV、犬细小病毒、犬腺病毒2型、狂犬病病毒中有效检测区分出CDV。本研究建立的胶体金试纸条检测方法灵敏度高、特异性强,适用于CDV临床快速诊断。

猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)对兔与猪免疫攻毒保护平行关系研究

用研制的连续3批猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)分别以不同剂量免疫健康兔和断奶仔猪,检测其免疫28 d后的血清抗体,采用血清中和试验法测定血清中和指数,并对免疫28 d后的兔和断奶仔猪分别进行攻毒,统计各组兔和断奶仔猪免疫后攻毒保护率。结果表明,兔免疫28 d后的血清抗体中和指数为794～1258时保护率为60%～80%,血清抗体中和指数≥1479时可获得100%保护;仔猪免疫28 d后的血清抗体中和指数为229～269时保护率为60%～80%,血清抗体中和指数≥331时可获得100%保护。兔与仔猪对猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)均产生良好的免疫应答反应,抗体值较高者获得保护率相对较高,兔与猪免疫与攻毒保护呈现平行关系。

猪伪狂犬病不同佐剂灭活疫苗对兔免疫原性初探

采用分离鉴定的猪伪狂犬病毒(HB-J株)以4种佐剂研制成4批灭活疫苗,以研究其对兔的免疫原性。疫苗分别免疫PRV抗体阴性兔后,用乳胶凝集试验法(LAT)和中和试验法(SNT)对试验兔进行血清抗体检测;于免疫后21、28 d对试验兔分别进行攻毒,观察兔保护情况。试验结果表明,兔对不同佐剂的猪伪狂犬病疫苗均产生良好的免疫应答反应,且当兔免疫后血清凝集价≥1∶32或血清抗体中和指数≥1479或中和价≥1∶16时,可以抵抗10 LD50剂量强毒的攻击;当兔免疫后血清凝集价≥1∶64或血清抗体中和指数≥2187或中和价≥1∶32时,可以抵抗100LD50剂量强毒的攻击;4种佐剂灭活疫苗均具有良好的免疫效果。

一种鸡抗猪丁型冠状病毒阳性血清的制备方法

为研究用鸡制备猪丁型冠状病毒(PDCoV)阳性血清,将PDCoV用二乙烯亚胺(BEI)灭活,加矿物油佐剂乳化制成疫苗,多次免疫SPF鸡,采集血清,检测血清中和效价并用间接免疫荧光法(IFA)检测PDCoV。结果显示,血清中和效价随免疫次数增加逐渐增高,4免后14 d的中和效价平均值为1314;制备的阳性血清可用于IFA检测PDCoV,其不与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)反应,特异性良好。本研究用鸡成功制备PDCoV阳性血清,为利用鸡制备其他猪病阳性血清奠定基础。

ST细胞全悬浮培养的驯化及其培养伪狂犬病毒的工艺研究

将Siat7e基因转染ST细胞,筛选,驯化得到一株可悬浮培养的ST细胞株,此株细胞能够稳定连续传代,适应无血清、高密度培养,最高密度可达6×10^(6)/mL,从摇瓶放大至生物反应器,生长稳定;采用驯化的全悬浮ST细胞培养伪狂犬病毒,从接毒时细胞密度、接毒量、收获时间三个方面优化了伪狂犬病毒的培养参数,确定接毒时细胞密度为2.0×10^(6)/mL~3.0×10^(6)/mL,接毒量为0.1 MOI~1 MOI,收毒时间为接毒后24 h~36 h。经过50 L生物反应器3个批次的工艺验证,培养的病毒含量均不低于109.0TCID50/mL,说明驯化的ST全悬浮细胞适合伪狂犬病毒的培养。

免疫小鼠血清中猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒的研究

为研制一种小鼠血清中猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)抗体检测试剂盒,以PCV2 Cap蛋白兔多抗作为包被用抗体,捕获纯化的PCV2 Cap蛋白,制备抗原检测板,辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG作为二抗,建立检测小鼠血清中PCV2抗体ELISA检测方法并制备试剂盒。采用所制备的ELISA试剂盒对50份已知阴性血清样本进行检测,临界OD_(450nm)值为0.335;采用ELISA试剂盒与IFA分别对100份血清检测,总符合率为96%,检测小鼠血清敏感性效价达1∶16000,与其他常见的猪病毒小鼠阳性血清无交叉反应,2~8℃保存15个月稳定,批内变异系数为2.28%~4.17%,批间变异系数为4.27%~6.02%,具有良好的敏感性、特异性、稳定性及重复性;采用ELISA试剂盒对不同来源疫苗免疫组小鼠血清进行检测,均显示良好效果。研究表明,本研究制备的ELISA试剂盒可用于小鼠血清中PCV2抗体效价检测。