丹酚酸B通过调控SIRT1/NF-κB/p53通路减轻缺氧/复氧诱导的大鼠肝细胞损伤

目的探究丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)减轻缺氧/复氧(H/R)诱导的大鼠肝细胞损伤及潜在的分子机制。方法体外培养BRL-3A大鼠肝细胞株,制备BRL-3A的H/R模型,予以Sal B干预。CCK-8检测细胞活力;微板法测转氨酶含量;ELISA测炎性因子的含量;流式细胞术测细胞凋亡水平;Western blot和实时荧光定量PCR(q PCR)检测SIRT1、NF-κB p65、p53、Bax、Bcl-2蛋白及mRNA表达水平。结果 H/R诱导的大鼠肝细胞活力下降;细胞上清液中ALT、AST、TNF-α、IL-1β含量明显增多;细胞凋亡率明显升高;SIRT1和Bcl-2在蛋白及mRNA水平的表达下调,而NF-κB p65、p53和Bax在蛋白及mRNA水平的表达上调。在Sal B预处理后,细胞活力升高;细胞液中ALT、AST、TNF-α及IL-β的含量下降;细胞凋亡率降低;SIRT1和Bcl-2在蛋白水平及mRNA水平的表达升高,NF-κB p65、p53和Bax在蛋白水平及mRNA水平的表达降低。结论丹酚酸B可有效减轻H/R诱导的大鼠肝细胞损伤,其机制可能与SIRT1/NF-κB/p53通路有关系。

GSK-J4通过抑制STAT3磷酸化对HepG2肝癌细胞凋亡和侵袭的影响

目的探讨GSK-J4通过抑制组蛋白去甲基化酶含Jumonji结构域蛋白3(Jumonji domain-containing protein 3,Jmjd3)并上调H3K27me3的表达影响HepG2肝癌细胞凋亡和侵袭的分子机制。方法体外培养人正常肝细胞L02及人肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞株HepG2、SMMC7721,RT-PCR检测Jmjd3 m RNA表达,Western blot检测Jmjd3、H3K27me3蛋白表达;CCK-8法检测不同浓度GSK-J4(0、10、30、50μmol/mL)处理HepG2后增殖能力;流式细胞仪检测凋亡率;Transwell检测细胞侵袭力;Western blot检测Jmjd3、H3K27me3和凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Caspase3、上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标记物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)以及p-STAT3、STAT3蛋白表达。结果与L02比,Jmjd3高表达,H3K27me3低表达于HepG2、SMMC7721肝癌细胞株(P<0.05);GSK-J4抑制HepG2增殖(P<0.05);GSK-J4处理组细胞凋亡率明显提高,细胞侵袭能力减弱(P<0.05);GSK-J4处理HepG2后Jmjd3水平降低,H3K27me3水平增高,Bcl2水平降低,Bax、Caspase3水平增高,E-cadherin表达增高,Vimentin水平降低(P<0.05);p-STAT3表达下调(P<0.01)。结论 GSK-J4通过抑制Jmjd3并上调H3K27me3表达而诱导HepG2发生凋亡并减弱侵袭,其可能与抑制EMT形成和STAT3的磷酸化有关。

白藜芦醇在缺氧/复氧诱导的肝细胞损伤中的保护作用及与TLR4/NF-κB通路的关系

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)在缺氧/复氧(hypoxia reoxygenation,H/R)诱导的大鼠肝细胞损伤中的保护作用及其相关分子机制。方法建立BRL-3A细胞(大鼠肝细胞株)H/R模型。建模前分别用RES和TLR4抑制剂(HTA125)预处理细胞。建模完成后,检测细胞存活率及细胞凋亡,观察细胞形态变化,检测细胞培养液中谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)及炎症因子含量,检测细胞TLR4、NF-κB p65基因mRNA及蛋白水平表达及NF-κB p65入核情况。结果 H/R条件使细胞存活率明显降低,细胞凋亡率增加(P<0.01),受损细胞明显增多,ALT、IL-1β含量增多(P<0.01),TLR4和NF-κB p65表达水平显著提高(P<0.01),p65入核细胞比例提高(P<0.01)。经RES及HTA125预处理后,细胞存活率显著提高,细胞凋亡比例显著缩小(P<0.01),受损细胞减少,ALT、IL-1β含量降低(P<0.01),TLR4和NF-κB p65表达水平明显降低(P<0.01),p65入核细胞比例下降(P<0.01)。结论 RES可以减轻H/R诱导的BRL-3A肝细胞损伤,该作用可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。

小鼠肝脏原代Kupffer细胞的分离和纯化

目的利用低速离心和差速贴壁的特性,探索一种高效分离纯化BALB/c小鼠Kupffer细胞(KC)的方法。方法采用0.5 g/L 4型胶原蛋白酶原位灌注和消化肝脏组织,低速分离肝脏的细胞后差速贴壁分离纯化KC,与Percoll密度梯度离心分离方法比较KC的产量和活性,应用F4/80免疫荧光染色鉴定细胞形态、流式细胞术检测F4/80的表达、墨汁吞噬实验进行吞噬功能鉴定。构建KC缺氧/复氧模型,流式细胞术检测主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ、CD40、CD68和CD86的表达,ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达。结果每只小鼠肝脏可获得(5.83±0.54)×106个KC,细胞存活率达92%,Percoll密度梯度分离仅能获得(2.19±0.43)×106个KC,F4/80免疫荧光染色显示贴壁后KC呈梭形或棘状,流式细胞术鉴定F4/80阳性细胞占比接近90%,吞墨实验可见胞质内大量被吞噬的碳颗粒。KC在缺氧复氧模型下MHC-Ⅱ、CD40、CD86分子表达增多,并分泌TNF-α参与炎症反应。结论成功建立了BALB/c小鼠KC分离纯化的方法。

miR-148a通过抑制Ca^(2+)/钙调蛋白依赖激酶Ⅱα(CaMKⅡα)减少小鼠肝缺血再灌注损伤

目的探讨miR-148a通过抑制Ca2+/钙调蛋白依赖激酶Ⅱα(Ca MKⅡα)对肝缺血/再灌注(I/R)损伤的影响及其机制。方法建立小鼠肝I/R模型,采用实时定量PCR检测miR-148a、Ca MKⅡα、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)mRNA的表达,Western blot法检测肝脏组织Ca MKⅡα的表达;HE染色观察各组肝组织的形态学变化,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测肝细胞凋亡情况。结果肝I/R后miR-148a表达上调,与Ca MKⅡα表达水平呈负相关;外源性miR-148 a模拟物处理肝I/R损伤小鼠后,Ca MKⅡα、TNF-α、IL-1βmRNA的表达水平下降,肝脏组织炎性细胞浸润及肝实质细胞坏死减少,肝细胞凋亡降低。结论 miR-148a可通过抑制Ca MKⅡα的表达而缓解肝I/R损伤。

漆黄素通过调控TLR4/NF-κB通路减轻大鼠肝细胞缺氧/复氧损伤

目的探讨漆黄素对大鼠肝细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的保护作用及其机制。方法构建BRL-3A大鼠肝细胞H/R模型,并给予漆黄素处理。CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,微板法检测细胞上清液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;ELISA检测细胞上清液肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)的水平,实时定量PCR检测BRL-3A细胞Toll样受体4(TLR4)、核因子κBp65(NF-κBp65)mRNA水平,Western blot法检测TLR4、NF-κBp65蛋白水平。结果 H/R处理的BRL-3A细胞存活率下降,细胞凋亡增多,培养细胞上清中ALT、AST水平和IL-1β、TNF-α升高;漆黄素处理可提高细胞存活率,减少细胞凋亡,降低ALT、AST水平,抑制IL-1β、TNF-α的释放,同时抑制H/R诱导的TLR4、NF-κBp65水平升高。结论漆黄素可能通过调节TLR4/NF-κB信号通路减轻大鼠肝细胞H/R损伤。

miR-21通过抑制PTEN/PI3K/AKT信号通路减轻小鼠肝细胞缺氧/复氧损伤

目的探讨体外实验中miR-21对C57BL/6J小鼠原代肝细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的影响及其可能的分子机制。方法建立体外原代培养肝细胞H/R模型,采用实时定量PCR检测miR-21的表达;Western blot法检测肝细胞中第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)、磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)、Bcl-2、Bax的蛋白表达水平;流式细胞术检测肝细胞凋亡。结果原代培养肝细胞在H/R处理后miR-21表达下调;而外源性miR-21模拟物处理的肝细胞经H/R后PTEN表达降低、p-AKT表达升高、Bcl-2表达水平及Bcl-2/Bax比值升高,肝细胞凋亡减少,而抑制AKT磷酸化可导致肝细胞Bcl-2表达水平及Bcl-2/Bax比值降低,肝细胞凋亡增加。结论 miR-21可通过抑制PTEN/PI3K/AKT信号通路减轻H/R导致的肝细胞凋亡,减轻H/R过程中肝细胞的损伤。

IPI549调控小鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用研究

目的:研究IPI549特异性抑制PI3Kγ对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用。方法:构建C57BL/6J小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型和RAW264.7巨噬细胞缺氧复氧模型,给予IPI549(PI3Kγ抑制剂)干预,以ALT、HE染色、TUNEL判断肝脏损伤情况,Western blot检测组织和原代细胞p110γ(PI3Kγ)蛋白表达变化和RAW264.7细胞缺氧复氧过程TNF-α、JNK、p-JNK蛋白表达情况,ELISA检测细胞上清TNF-α水平。结果:相比于原代肝细胞,枯否细胞明显高表达p110γ。与Sham组比较,IR组肝组织中p110γ的蛋白水平降低;使用PI3Kγ特异性抑制剂(IPI549)干预小鼠,可加重小鼠肝脏缺血再灌注后肝组织损伤和肝脏组织细胞凋亡,而利用GdCl3预处理封闭枯否细胞,可使得IPI549引起的肝组织细胞损伤和凋亡加重得到缓解。在体外实验中,IPI549干预使RAW264.7细胞缺氧复氧过程JNK磷酸化水平升高、TNF-α蛋白表达增加,细胞上清TNF-α分泌增多。结论:PI3Kγ抑制剂IPI549干预使小鼠肝脏缺血再灌注损伤加重,其机制与IPI549抑制枯否细胞中的PI3Kγ影响JNK信号通路的活化,发挥促炎作用有关。

谈谈“观察力”对物理实验的重要性

“观察对于儿童之必不可少,正如阳光、空气、水 分对于植物之必不可少一样。在这里,观察是智慧的 最重要的能源。”这句话是苏联著名教育家苏霍姆林 斯基对观察的重要性的论述。可以说,观察是一切科 学研究的源头,也是任何新发现、新发明的入口。在 我国新颁布的多个学科的课程标准中,都强调了观 察对学生学习的重要性。

符合米兰标准和杭州标准的肝癌肝移植受者预后回顾性分析

目的比较符合米兰标准和符合杭州标准的肝细胞肝癌(HCC)患者行肝移植术后生存和肿瘤复发情况,验证杭州标准的临床应用价值。方法回顾性分析2006年1月至2011年12月中国肝移植注册登记的肝移植手术,并在浙江大学医学院附属第一医院、重庆医科大学附属第一医院两家肝移植中心接受随访调查受者的临床资料,196例肝癌肝移植受者纳入研究。将符合米兰标准的HCC患者作为米兰标准组,共90例(45.9%);超出米兰标准但符合杭州标准者作为杭州标准组,共40例(20.4%);肿瘤结节直径之和>8 cm,术前AFP>400 ng/m L且组织学分级为低度分化者作为超出杭州标准组,共66例(33.7%)。比较3组受者术后生存率、无瘤生存率,并评判预后。结果米兰标准组受者术后1、3、5年生存率和1、3、5年无瘤生存率分别为88.9%、73.3%、60.0%和84.4%、66.7%、51.1%,杭州标准组受者术后1、3、5年生存率和1、3、5年无瘤生存率分别为80.0%、65.0%、50.0%和75.0%、55.0%、45.0%,超出杭州标准组受者术后1、3、5年生存率和1、3、5年无瘤生存率分别为57.6%、30.3%、18.1%和45.5%、27.3%、18.1%。对3组受者术后累积生存率和无瘤生存率进行比较,米兰标准组和杭州标准组受者术后1、3、5年生存率和1、3、5年无瘤生存率差异均无统计学意义(P均>0.05),米兰标准组受者术后1、3、5年生存率和无瘤生存率均显著高于超出杭州标准组受者(P均<0.05),杭州标准组受者术后1、3、5年生存率和1、3、5年无瘤生存率均显著高于超出杭州标准组受者(P均<0.05)。结论同米兰标准一样,杭州标准也具有很强的科学性,能够显著拓展受益人群,让更多未符合米兰标准的患者能够施行肝移植术。同时杭州标准能有效预测肝移植受者预后,其创新性提出的生物学标准AFP水平和肿瘤分化程度是影响肝癌肝移植受者术后预后的关键性因素。