大肠杆菌多酚氧化酶的分子克隆及异源高效表达

菜籽粕、棉籽粕等非粮饲料资源存在的酚类化合物芥子碱、棉酚等抗营养因子,严重影响了其饲喂价值。本课题组筛选出的一株大肠杆菌属芥子碱降解菌SDB2已被证实能通过分泌多酚氧化酶来降解芥子碱和棉酚,本试验旨在运用基因工程技术克隆SDB2多酚氧化酶基因,实现其高效表达,为SDB2多酚氧化酶在饲料工业上的规模化应用奠定基础。从大肠杆菌SDB2中克隆出多酚氧化酶基因,将其与质粒pET28a连接后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养,通过PCR鉴定及质粒酶切验证方法构建重组菌株,同时对重组克隆基因进行生物信息学分析。采用“2×2”交叉试验设计,以温度和诱导剂IPTG浓度两个影响因素诱导SDB2多酚氧化酶基因在重组菌株中高效表达,经SDS-PAGE和WB双重验证后,确立最佳诱导条件,最终纯化出目标酶蛋白。结果表明:(1)成功克隆SDB2多酚氧化酶基因,构建出异源表达重组菌株。(2)克隆出的SDB2重组多酚氧化酶基因含目标核苷酸741个,总编码氨基酸263个(含标签氨基酸20个),氨基酸组成的蛋白相对分子质量为28499.0,理论等电点为6.94,据此预测出SDB2重组多酚氧化酶三维结构模型。(3)确立SDB2多酚氧化酶异源高效表达的最佳诱导条件为温度37℃,IPTG浓度1 mmol,该条件下表达出大量可溶性酶蛋白,有利于工业化生产。本试验条件下,大肠杆菌SDB2多酚氧化酶成功实现了分子克隆及异源高效表达,为我国非粮饲料资源实现高效利用提供了技术参考。

白芥子诱导的鸡内源性芥子碱降解菌的筛选、鉴定及酶活测定

本试验旨在通过分离鉴定白芥子诱导的芥子碱降解菌,并对其核心功能酶漆酶进行酶活测定,建立芥子碱的生物降解方法,为探寻白芥子等十字花科类非粮饲料资源的高效利用提供技术支撑。本试验以藏香鸡为模型,在基础日粮中添加20%白芥子饲喂28 d进行芥子碱降解菌体内诱导。分别采集鸡空肠、回肠、盲肠内容物在不同培养基中分离筛选芥子碱降解菌,对筛选出的优势菌进行形态学和分子生物学鉴定,测定该菌株的芥子碱降解效果和漆酶活性。结果表明:(1)在鸡盲肠中筛选出9株目标菌,筛出率明显高于空肠和回肠,并进一步选出1株芥子碱降解优势菌SDB2(Sinapine-degrading bacteria 2)。(2)经鉴定,SDB2菌株属于变形菌门;γ-变形菌纲;肠杆菌目;肠杆菌科;大肠埃希菌。(3)芥子碱浓度与SDB2菌株培养时间存在极显著的线性回归关系(P <0.01),芥子碱浓度随培养时间增加而降低,培养72 h的芥子碱降解率可达50%。(4)漆酶活力与SDB2菌株培养时间存在极显著的线性回归关系(P <0.01),漆酶活力随培养时间增加而降低。(5)漆酶活力与芥子碱浓度存在极显著的线性回归关系(P <0.01),漆酶活力与芥子碱浓度呈正相关。综上,本试验条件下,筛选出的SDB2能利用自身分泌的漆酶有效降解芥子碱,为高效利用十字花科类非粮饲料资源奠定了基础。