致肾盂肾炎大肠杆菌粘附素papG基因克隆及序列分析

目的 克隆F13型致肾盂肾炎大肠杆菌 (UPEC) 132株的粘附素基因papG并作序列分析。 方法 根据Ⅰ型papG(papGJ96 )和Ⅱ型 papG(papGIA2 )基因序列设计 3条引物 ,PG2和PG3分别为下游 3’端引物 ,PG1为两型papG上游 5’端共用引物 ,并在各引物 5’端加入限制性内切酶位点。以UPEC132染色体DNA为模板进行PCR扩增 ,将扩增产物克隆入质粒载体 ,筛选阳性重组质粒作序列分析。结果 UPEC132株以Ⅰ型 papG引物扩增时为阴性结果 ,以Ⅱ型 papG引物扩增时可获得约 110 0bp的DNA片段。扩增产物经克隆获得阳性重组质粒 pGC39和pGC10 3,对其序列分析显示 papG132编码337个氨基酸 ,与 papGJ96的同源性仅为 4 5 % ,而与 papGIA2的同源性为 98.6 %。与papGIA2比较 ,papG132核苷酸序列 +3位缺失 1个三联体密码 ,并在特异性受体结合域 +49位、+16 0位和PapD蛋白亚单位作用区 +2 72位、+314位存在错义突变 ,此外还存在 7处同义突变。结论UPEC132株的P菌毛不同于相同血清型的UPECJ96株 ,前者为F13型papA与Ⅱ型papG组合 ,后者为F13型 papA与Ⅰ型papG组合。Ⅱ型PapG粘附力较强 ,具有重要的临床意义。

P菌毛粘附素在致肾盂肾炎大肠埃希菌对小鼠尿道上行感染中的作用

目的 比较2株具有不同P菌毛粘附素(PapG)的同血清型UPEC和1株无菌毛大肠埃希菌对小鼠泌尿道上行感染性的差异,探讨粘附素在UPEC尿道感染中的作用。方法 通过17PEC尿道内接种形成BALB/c小鼠尿道上行感染;观察尿液、肾脏剖面的菌落计数和肾组织的病理改变。结果 具有P菌毛的UPEC菌株感染之小鼠,在其尿液和肾剖面培养出大量原感染菌,肾组织呈现中、重度急性肾盂肾炎的病理改变;不同P菌毛粘附素的UPEC感染的菌落计数、肾脏病理改变严重度无显著性差异;无菌毛大肠埃希菌感染之小鼠,其尿液和肾剖面只有少量原感染茵生长,肾组织为轻至中度急性炎症改变。结论具有不同粘附素之P菌毛在介导UPEC致小鼠上行性急性肾盂肾炎中均发挥重要作用;无菌毛大肠埃希菌亦可导致小鼠肾脏炎性改变。

避孕知情选择

“知情选择”是指人们对其生殖保健方面作出决定的一个动态的过程。在这一过程中 ,个人可以自主地、知情地决定是否接受或拒绝服务以及选择什么样的服务。避孕知情选择是知情选择在计划生育领域的应用 ,是计划生育服务质量的核心内容。本文回顾了全世界范围内的避孕现状以及实施避孕知情选择的必要性和紧迫性 ,以及中国实行避孕知情选择所面临的挑战和问题。

避孕方法知情选择干预对咨询服务效果的影响

目的 :评价咨询技巧培训对门诊服务提供者咨询服务效果的影响。对象和方法 :以计划生育门诊为基础 ,在基线调查后 ,对干预门诊服务提供者进行咨询技巧培训 ,项目结束时 ,通过对到干预门诊就诊的合格对象进行终末调查 ,来评估咨询服务情况及干预效果。结果 :培训干预措施显著提高了咨询服务水平 ,但仍有部分对象反映在咨询中存在服务提供者限制其使用某种避孕方法的现象。咨询服务质量的高低影响对象的避孕知识水平及其对现用避孕方法的满意程度。结论 :使咨询服务规范化 ,进一步提高服务提供者的咨询技巧 ,提高育龄群众的避孕知识普及程度。

致肾盂肾炎大肠埃希菌粘附素重组蛋白诱导小鼠免疫应答

目的获得UPECP菌毛粘附素PapG重组蛋白纯化产物,研究其诱导小鼠的免疫应答,为进一步的PapG疫苗及免疫学研究创造条件。方法GST-PapG重组蛋白经诱导表达和亲和层析纯化后接种于BALB/c小鼠;ELISA法检测小鼠免疫血清的抗体效价,以血凝抑制试验测定其免疫反应性。结果重组蛋白纯化产物可诱导小鼠产生针对PapG粘附素的特异性免疫应答,免疫小鼠血清抗体的效价显著升高,而且具有较强的血凝抑制作用。结论GST-PapG重组蛋白纯化产物具有良好的免疫原性,可用于UPEC抗粘附候选疫苗的筛选和进一步的免疫学研究。

致肾盂肾炎大肠杆菌P菌毛粘附素基因的型别鉴定

目的 从基因水平鉴定致肾盂肾炎大肠杆菌 P菌毛粘附素的类型。 方法 根据 P菌毛 型(Pap GJ96 )、 型 (Pap GIA2 )和 型 (Prs GJ96 )粘附素的基因序列 ,选择非同源区设计合成三对引物。以全菌 DNA样品为模板 ,应用普通 PCR和复合 PCR技术获得三型 pap G的扩增。 结果 U PEC J96分别产生 4 6 1bp和 2 5 8bp的DNA片段 ;U PEC132和 U PEC136均产生 190 bp的 DNA片段。无 P菌毛对照株为阴性扩增。复合 PCR结果与普通 PCR完全一致。Pap G1 32 扩增产物的序列分析表明其与 Pap GIA2 之间具有 97.9%的同源性 ,但存在 4处点突变。 结论 U PEC132株 P菌毛粘附素为 型 Pap G,但与国外同型 Pap G比较 ,存在基因变异。复合 PCR技术用于pap

泌尿道致病性大肠埃希菌PapG重组蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用

目的探讨泌尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)P菌毛粘附素PapG重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用。方法纯化蛋白按一定程序免疫BALB/c雌性小鼠,末次免疫后第7天用UPEC临床分离株进行尿道上行攻击;攻击后第5天检测尿液和肾脏培养菌,同时测定血清抗体效价。结果经GST-PapG重组蛋白和GST纯化蛋白免疫的小鼠体内均产生了相应的抗体,而仅经重组蛋白免疫的小鼠具有一定的抵抗毒株上行感染的能力,表现为肾脏培养菌量均明显减少。结论PapG粘附素与GST构成的重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染具有一定的免疫保护作用。

改良溶解圈纤溶酶原激活物测定法及其在革兰氏阴性菌中的应用

本研究建立的测定纤溶酶原激活物（Ｐｌａ）的纤维蛋白溶解圈法，不仅简单易行，而且具有很高的敏感性和特异性。检测灵敏度较原来的普通溶解圈法提高了大约５００倍，能检出２．５×１０－５ＩＵ的尿激酶（ＵＫ）活力。本方法特别适用于低Ｐｌａ含重的定性定量检测，如革兰氏阴性菌纤溶酶原激活物的测定。应用此方法，本研究首次证明了伤寒和鼠伤寒杆菌具有纤溶酶原激活物的活性，１０Ｄ鼠伤寒菌的Ｐｌａ活性相当于４×１０－２ＩＵＵＫ；１ＯＤ伤寒菌的Ｐｌａ活性相当于５×１０－３ＩＵＵＫ。

致肾盂肾炎大肠埃希菌黏附素表达载体构建及表达产物抗原性检测

目的 构建致肾盂肾炎大肠埃希菌 (UPEC) P菌毛黏附素 Pap G重组融合蛋白表达载体 ,检测该重组蛋白的免疫原性。 方法 设计并合成一对 P菌毛 Pap G黏附素结构基因的 PCR扩增引物 ;筛选、鉴定重组质粒。以 IPTG诱导 Pap G与 GST重组融合蛋白表达 ,表达产物经亲和层析纯化后用 Western blot分析。 结果 成功地构建 pap G结构基因重组表达载体 ,所表达的重组蛋白相对分子质量约 6 3k D,可为 UPEC P菌毛多克隆抗体所识别。 结论 所获得的 Pap G- GST重组融合蛋白纯化产物保持了天然抗原性 ,可用于疫苗研制及其他免疫学研究。

应用自杀性质粒载体构建鼠伤寒沙门氏菌Pla基因的位点专一性突变

带有ｐＳＶ１质粒的ＳＭ１０λπ寄主菌，由于ＳＭ１０λπ染色体上带有ＲＰ４的诱动性基因和促进Ｒ６Ｋ复制起点启动复制的π基因，故ｐＳＶ１质粒能够复制且可被诱动。被研究的鼠伤寒沙门氏菌ｐｒｔＡ基因，经人工拼接Ｋｍ抗性基因的插入钝化后，连接到ｐＳＶ１质粒上，所构建的质粒就可被诱动到鼠伤寒沙门氏菌体内。由于在新的寄主菌内缺乏π基因，ｐＳＶ１的Ｒ６Ｋ复制起点缺少π蛋白的帮助无法进行自我复制，表现出自杀性质粒的功能，而其上被Ｋｍ基因插入的ｐｒｔＡ势必与染色体上同源的ｐｒｔＡ进行交换，使染色体上ｐｒｔＡ基因出现位点特异性诱变。经测定原始从发菌株，诱变菌株的ｐｌａ功能后，证实后者功能被人工地失活，说明ｐｒｔＡ基因具有编码ｐｌａ的功能。本方法的建立将为革兰氏阴性杆菌染色体上任何基因的研究找到一条简便有效的途径。

通过微生物学教学加强医学生的科研技能

对医学生科研能力的培养是创新型医学科研人才培养的重要途径。充分利用医学微生物学教学的特点,通过改革传统实验教学模式,可使医学院校本科学生接受科研能力的基本训练,为将来独立进行科学研究打下良好的基础。

登革2型病毒E抗原基因的RT-PCR扩增及表达载体的构建

目的扩增并克隆登革２型病毒Ｅ抗原基因，构建Ｅ抗原基因表达载体。方法应用ＲＴ－ＰＣＲ法、基因克隆和限制性内切酶酶切分析。结果增殖病毒标准株并提取病毒总ＲＮＡ。在登革２型病毒Ｅ抗原基因两侧疏水区内设计一对ＰＣＲ引物。通过ＲＴ－ＰＣＲ，获得１６００ｂｐＥ抗原编码基因全长ＤＮＡ片段，将其克隆至ｐＫＫ２２３－３质粒的ｔａｃ启动子下游构建成Ｅ抗原表达载体。结论为型特异性Ｅ抗原基因的进一步亚克隆和表达奠定基础；为其他型别登革病毒Ｅ抗原基因的同类研究提供借鉴。

大肠杆菌asd基因PCR引物设计及其长模板PCR扩增

目的获得大肠杆菌全长ａｓｄ基因。方法采用计算机引物设计软件，长模板ＰＣＲ扩增法及限制性内切酶酶切分析。结果设计一对Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因ＰＣＲ引物；经长模板ＰＣＲ扩增获得１５１０ｂｐＰＣＲ扩增片段；经限制性内切酶酶切分析，证明该片段与电脑查询的Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因酶切谱相同。结论以本文设计的引物用长模板ＰＣＲ扩增法得到的片段初步确认为Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因。

产超广谱β-内酰胺酶细菌微量表型确证试验及其应用评价

目的建立产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)确证的快速微量检测法,评价该方法在筛检工作中的应用效果。方法以灭菌的96孔酶标板建立ESBL微量快速确证试验,用已知59株产ESBL大肠埃希菌、33株非产ESBL大肠埃希菌和质控菌株进行试验的真实性、可靠性和收益评价。结果重复试验符合率100%;用酶标仪自动判读敏感度达到或超过94.92%,特异度和阳性预测值均为100%,与美国国家实验室标准化研究所(CLSI)推荐标准检测方法所得到的结果差别无统计学意义(P>0.05)。结论ESBL微量确证试验具有良好的真实性、可靠性和检测效益;操作简便、经济、快捷。

PapG重组蛋白免疫血清抗UPEC粘附作用的研究

目的探讨尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)P菌毛粘附素PapG重组蛋白免疫血清的体外抗细菌粘附作用。方法建立UPEC的Vero细胞感染模型,制备PapG重组蛋白和谷胱甘肽S-转移酶(GST)担体蛋白免疫血清,检测这两种抗血清在血凝和细胞粘附抑制试验中的作用。结果重组蛋白免疫血清可抑制UPEC野生株所产生的甘露糖抗性血凝;可明显降低细菌对Vero细胞的粘附率,减轻或延缓细菌对细胞的毒性作用。而担体蛋白免疫血清则无上述作用。结论由PapG粘附素与GST构成的重组融合蛋白(GST-PapG)诱导产生的免疫血清在体外具有抵抗UPEC粘附的能力,而且这种抗粘附作用主要针对P菌毛的PapG粘附素。

泌尿道致病性大肠埃希菌Ⅰ型PapG黏附素基因的扩增与分析

目的获得Ⅰ型黏附素代表菌株———泌尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)J96 PapG全基因扩增片段并进行克隆子分析。方法设计合成一对可扩增Ⅰ型papG全长基因的PCR引物,采用长片段PCR扩增法获得该基因的扩增片段,以限制性内切酶酶解后克隆pUC18质粒载体。结果限制性酶谱、PCR和序列分析表明,所获得重组质粒pJG29中已带有Ⅰ型papG全长基因片段的克隆。结论所设计合成的引物和建立的PCR扩增法可用于大量获取并分析UPECⅠ型黏附素基因。

丙型肝炎病毒抗体一步快速检测法及与ELISA的比较

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）引起的一种非肠道传染性肝炎。感染ＨＣＶ后，５０％～８５％的病人转为长期带毒者；其中２５％的病人于５～１０年左右出现肝硬化甚至肝癌［１，２］。ＨＣＶ主要通过输血、静脉毒品注射针头、性传播和一定程度的家庭传播。因此，现在...

在综合基础上创新——鼠伤寒菌pla基因及其功能研究的思考

鼠伤寒菌pla基因及功能的研究从课题确立到取得结果整个过程,充分展现了综合研究方法在现代科学研究中的重要作用;在综合基础上的创新是科学研究成功的中心环节。