利用酵母双杂交研究铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB的自身相互作用

从铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)PCC7820中克隆了生物钟基因kaiB,并将其克隆入酵母双杂交系统的两个质粒pGADT7和pGBKT7中。经测序验证后,将重组质粒pGADT7-kaiB和pGBKT7-kaiB转化酵母菌AH109进行自激活性和自身相互作用的检测和验证。结果表明,铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB无自激活性,KaiB蛋白自身能发生相互作用。因此,可用KaiB蛋白为诱饵利用酵母双杂交系统筛选文库钓取与KaiB发生相互作用的蛋白。

采用PhR-L20C光生物反应器培养转胸腺素α1基因蓝藻的研究

采用PhR L20C光生物反应器对转胸腺素α1基因聚球藻Synechococcussp.PCC7942进行6批次的培养,结果表明,采用本实验室优化后的培养条件,根据该型气升式光生物反应器所具备的各项性能指标和参数条件进行培养,一个培养收获周期为6d,平均生长速率为0.61OD730/d,6d后藻细胞平均终浓度达到OD730=4.27,绘制了转基因藻细胞的光密度与其干质量的标准曲线,通过曲线得出产率平均约为0.36g/(Ld),最高0.40g/(Ld);最终细胞密度平均可达2.52g/L,最高2.84g/L.

铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiA的自身相互作用研究

蓝藻虽为原核生物,但它也和真核生物一样具有生物钟,它的固氮作用、光合作用、氨基酸吸收、细胞分裂以及基因表达等生理代谢过程都受到生物钟的调控,具有昼夜节律性.虽然蓝藻生物钟和真核生物钟一样,都以近24h的周期运行,都具有温度补偿效应,光、温等环境因素都能重置生物钟的时相,但组成蓝藻生物钟的钟蛋白与真核生物钟蛋白间不具有任何同源性,蓝藻生物钟的计时机制也与真核生物钟存在差异[1-2].

铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa PCC7820生物钟基因的克隆及其蛋白相互作用分析

为了深入研究铜绿微囊藻生物钟调控的分子机制,根据蓝藻钟基因的同源序列设计合成了简并引物,通过PCR和染色体步行的方法获得了铜绿微藻Microcystis aeruginosa PCC7820的生物钟基因簇kaiABC。kaiA基因全长873bp,编码一个由290aa组成,分子量大小为33.3kDa的蛋白;kaiB基因全长315bp,编码分子量大小为11.8kDa的蛋白;kaiC基因全长1563 bp,编码蛋白分子量大小为58.3kDa。Kai蛋白间的相互作用是昼夜节律计时产生的重要过程,利用酵母双杂交系统检测了三种Kai蛋白间的相互作用,结果表明KaiA、KaiB和KaiC蛋白自身及KaiA与KaiC、KaiB与KaiC之间都能发生明显的相互作用,而KaiB和KaiA之间没有检测到相互作用。

铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiC的自激活活性和自身相互作用研究

通过PCR扩增了铜绿微囊藻的生物钟主控基因KaiC,并将其分别克隆到酵母双杂交系统的诱饵质粒pGBKT7和猎物质粒pGADT7中,然后将重组质粒pGBKT7-kaiC/pGADT7-kaiC和pGBKT7-kaiC/pGADT7分别共转化酵母菌AH109,经营养缺陷生长和β-半乳糖苷酶印迹检测表明,KaiC蛋白不具有毒性不会影响酵母细胞的生长,也不具有自激活活性,不会激活报告基因的表达,并且KaiC蛋白自身存在较强的相互作用。诱饵质粒pGBKT7-kaiC可用于从基因组文库中筛选KaiC的相互作用蛋白。