样本采集及寄送条件对苹果病毒RT-PCR检测效果的影响

为了解决采样季节、采样部位及寄送条件不规范影响苹果病毒样本检测可靠性的问题,以携带苹果锈果类病毒(Apple skin scar viroid,ASSVd)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus,ACLSV)、苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApMV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)的苹果植株为试材,采用RT-PCR检测技术,研究了在不同月份采集果树不同组织部位,带毒样本在不同温度下保存不同时间,比较RT-PCR检测效果,以期为规范苹果病毒检测样本的采集、保存与寄送方式提供依据。结果表明:10月采样进行ASSVd、ACLSV、ApMV、ASPV RT-PCR检测,与其它时期相比检出率相对较高,以冠层下部1年生枝皮顶梢为材料对4种病毒进行RT-PCR检测,与其它组织部位相比检出率相对较高。4月采样,进行ASGV RT-PCR检测,检出率相对较高,冠层上部1年生枝皮顶梢较其它组织部位检出率高。1年生枝皮样本在4、25℃保存对RT-PCR检测影响相对较小,保存1 d和3 d,3棵树5种病毒的检测结果均为阳性,4℃条件下保存5 d,除ApMV,其它4种病毒3棵树检测结果均为阳性,保存7 d及以上多数病毒在测试温度下(0、4、25、37℃)检测结果为阴性。

苹果花脸病田间病情发展及ASSVd在组培条件下的传播

为了明确苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)引起的苹果花脸病在田间的病情发展情况以及ASSVd在组培条件下的传播方式,2012—2015年对河北省顺平南神南村3个果园进行持续调查和检测。结果显示,果园A、B、C的显症率分别从3.00%、19.35%和10.00%上升至10.00%、34.41%和22.00%,带毒率分别从11.00%、20.43%和14.00%上升至23.00%、37.63%和30.00%,带毒率和显症率都逐年增加,而且带毒率大于显症率,即有些带毒果树不显症。发病果树田间分布有明显的发病中心。通过高通量测序发现显症果树ASSVd vsiRNA reads数是带毒未显症reads数的4.08倍,同时实时荧光定量PCR检测发现显症树ASSVd病毒积累量显著高于带毒未显症树。以携带ASSVd的组培苗和无毒组培苗为试材,利用RT-PCR检测明确了ASSVd可通过伤口沾染带毒汁液、组培剪污染、含毒培养基、根系接触进行传播,其中根系接触传染率较高。

苹果锈果类病毒实时荧光定量反转录PCR检测及其在苹果树体内的扩散转移规律

为明确苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)在苹果树体内的转移规律,本研究建立高灵敏度的实时荧光定量反转录PCR(real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)方法,利用此方法检测该病毒在树体内的转移规律以及苹果果实上病毒积累量与症状的相关性。结果表明,本研究所建立的RT-qPCR检测技术能针对枝皮、果实、根组织中的ASSVd进行准确、灵敏的检测,检测灵敏度下限为41.00 fg/μL(相当于5.95×105copies/μL RNA);在嘎拉苹果树上接种ASSVd,2个月后植株各组织部位病毒积累量均较高,尤其是接种枝先端和树冠下层枝组,根部病毒积累量很少;接种4个月后,各组织部位病毒积累量下降,病毒在植株上部、下部和根部均匀分布;接种6个月后,在接种枝中下部和根部病毒积累量相对较高;接种8个月后,地上部各组织部位病毒积累量很低,主要集中在根部。在花脸症果实着色不同的果皮中ASSVd积累量差异显著,未着色果皮病毒积累量是着色果皮的4~40倍。表明ASSVd自果树枝干嫁接接种后,病毒先在接种枝中增殖,然后向根部转移,病毒的增殖和转移可能主要受寄主生长发育时期的影响,花脸病症状表现与病毒积累量密切相关。

苹果锈果类病毒(ASSVd)保定分离物草本寄主鉴定及侵染性cDNA克隆构建

由苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)引起的苹果花脸病在我国苹果生产上造成了严重的危害,构建侵染性cDNA克隆是研究病毒基因功能、病毒侵染机制的重要手段。我们首先在温室进行了ASSVd保定分离物(BD-1)草本寄主的鉴定,证明了ASSVd BD-1可侵染油菜(Brassica napus)、黄瓜(Cucumis sativus)、扁豆角(Lablab purpureus)、蚕豆(Vicia faba)、长豆角(Vigna unguiculata)、昆诺藜(Chenopodium quinoa)、苋色藜(C.amaranticolar)共7种草本植物,在油菜上病毒接种成功率最高,达80%,新生叶片表面凹凸不平;其次是黄瓜,达到了77.78%,新生叶片皱缩畸形。通过RT-PCR扩增到ASSVd BD-1全基因组,利用引物引入的方法在基因组中引入T7启动子,构建到pMD18-T simple载体上,通过体外转录获得病毒基因组RNA转录本,在油菜上验证了RNA转录本的侵染性。研究结果为利用草本寄主探究ASSVd生物学特性提供了基础材料,为利用反向遗传学方法分析ASSVd基因功能和侵染机理奠定了基础。