驴源马疱疹病毒8型的分离鉴定与生物信息学分析

本研究旨在分离1株驴源马疱疹病毒8型(Equine herpesvirus type 8,EHV-8)毒株并分析其遗传特征。从山东省聊城地区某驴场采集病驴肺脏组织,经PCR方法鉴定EHV-8的感染情况;对EHV-8感染阳性的肺组织进行研磨,经反复冻融后接种于兔肾细胞(RK-13)细胞中,盲传3代,待出现细胞病变(CPE)时收集细胞,并通过PCR、间接免疫荧光试验、透射电镜等技术对EHV-8进行鉴定。利用PCR扩增获得分离株的ORF 70全基因组序列,并进行生物信息学分析。研究结果显示,经PCR鉴定获得EHV-8感染阳性的肺脏组织,病料接种易感细胞RK-13后出现典型CPE,分别收集前3代的细胞培养物,经PCR扩增,均获得与预期大小一致的ORF 70基因片段,将分离获得的EHV-8毒株命名为SDLC66,序列上传GenBank,获得登录号:MW816102。经测序和序列比对发现,SDLC66毒株与AHV-3毒株(GenBank登录号:U24184.1)ORF 70基因的相似性为99%,与国内的EHV-8 wh毒株(GenBank登录号:JQ343919.1)、国外EHV-8/IR/2015/40(GenBank登录号:MF431614.1)、EHV-8/IR/2003/19(GenBank登录号:MF431611.1)参考毒株的相似性最高,均为99.8%。经遗传进化树分析发现,SDLC66与EHV-8(EHV-8 wh、EHV-8/IR/2015/40和EHV-8/IR/2003/19株)在一个小分支上,亲缘关系最近;与EHV-1型参考毒株(Hong Kong/57/1984、United Kingdom/32/1982、Oxfordshire/206/2013株)序列来源于同一大分支,亲缘关系较近,与EHV-4毒株(91c1和TH20p株)亲缘关系较远。间接免疫荧光试验可见与病毒蛋白特异结合的红色荧光信号;透射电镜观察可见直径约110 nm的圆形病毒粒子,并且核衣壳外有一层亮晕,亮晕外有一层囊膜。说明本试验成功分离得到1株驴源EHV-8毒株,为进一步研究其致病性和致病机制奠定基础。

马疱疹病毒8型gD蛋白的生物信息学分析及多克隆抗体制备

旨在探索马疱疹病毒8型(Equine herpesvirus type 8,EHV-8)囊膜蛋白gD的生物信息学特性、原核表达和多克隆抗体制备。用生物信息学分析软件对gD基因编码蛋白质的理化性质、亲/疏水性和跨膜区进行分析,以EHV-8 SDLC66毒株为模板,通过PCR扩增gD蛋白的胞外区并克隆至pET-32a(+)载体中,将重组质粒pET-32a-gD转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,收集菌体超声破碎,纯化并获得重组gD蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,用间接ELISA测定所制备多克隆抗体的效价,同时用Western blot与间接免疫荧光试验(IFA)明确所制备多克隆抗体的特异性。结果表明,EHV-8 gD编码的蛋白稳定,是亲水性蛋白,有跨膜区,位于30-330 aa。gD蛋白跨膜区正确克隆入pET-32a(+)载体,获得重组质粒pET-32a-gD。重组gD蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,分子质量约为55 ku,将其纯化后免疫新西兰兔获得抗gD多克隆抗体,该抗体的效价高达1∶200 000,Western blot与IFA结果表明该多克隆抗体具有良好的特异性。