基于NF-κB通路探究重楼皂苷Ⅶ的抗炎作用机制

目的:探讨重楼皂苷Ⅶ(PSⅦ)的抗炎作用及机制。方法:利用MACS法从C57BL/6小鼠脾脏中分离初始T淋巴细胞。PSⅦ处理后,通过流式细胞术、RT-qPCR、Western blot检测PSⅦ对IL-6表达水平的影响;利用流式细胞术、Cell TraceTM Violet试剂盒检测PSⅦ对CD4+T细胞活化及增殖分化的影响;利用Western blot检测PSⅦ对IκBα、STAT3及其磷酸化蛋白表达的影响;RNA-seq检测PSⅦ处理后的差异基因。结果:PSⅦ显著抑制IL-6的表达。PSⅦ对CD4+T细胞的活化及增殖无明显影响,但对其分化有一定影响。PSⅦ抑制p-IκBα、p-STAT3的蛋白表达水平,但对IκBα、STAT3无影响。RNA-seq分析的差异基因有70个(27个上调、43个下调),从中筛选出6个并利用RT-qPCR得到验证。结论:PSⅦ可通过STAT3和NF-κB信号通路抑制IL-6的表达,从而缓解炎症。

特异性CDR3区取代型γδTCR转染细胞的构建及生物学功能鉴定

目的:建立特异性CDR3区取代型γδTCR转染细胞平台。方法:利用搭桥PCR的方法将已知的γδT细胞克隆DBS4.3特异性CDR3编码序列嵌入到γ9和δ2cDNA序列中,取代原有的CDR3区序列,获得的全长γ9和δ2链分别插入真核表达载体pREP7和pREP9中,共转染J.RT3-T3.5细胞,双压力抗生素筛选获得表达特异性γδTCR的转染细胞,通过ELISA和Re-altime PCR检测该转染细胞在接受抗原刺激后IL-2的分泌情况。结果:ELISA和Realtime PCR结果显示表达DBS4.3特异性γδTCR的转染细胞在DBS4.3特异性抗原仲丁胺和抗γδTCR抗体刺激作用下,活化分泌IL-2。结论:构建了特异性CDR3区取代型γδTCR转染细胞平台,为研究γδTCR识别抗原的机制奠定了基础。

肿瘤特异性基因的筛选

目前,肿瘤的生物治疗已成为肿瘤治疗的新模式,生物治疗主要包括肿瘤的免疫治疗和基因治疗.从目前国际研究的趋势分析,从实际应用的角度推测,肿瘤的免疫治疗将会有广泛的应用前景.

获取充足肺腺癌及同源正常组织全长cDNA有效方法的探讨

目的 获取肺腺癌及同源正常组织完整的RNA分子 ,并由此逆转录成全长cDNA ,经各种杂交手段 ,筛选未知基因片段。方法 从肺腺癌及同源正常组织中分别提取总RNA ,经琼脂糖凝胶电泳确认RNA未降解后 ,在oligodT primer的引导下 ,将mRNA逆转录成dscDNA ,并在dscDNA上游及下游连接上不同的适配子 (adaptor) ,连接适配子的dscDNA分别在不同的引物引导下 ,经PCR扩增并富集出大量的全长cDNA。结果 扩增出肺腺癌及同源正常组织的全长cDNA ,肺正常组织的cDNA基因片段在 0 .3～ 1 .9kb之间 ,而肺腺癌的片段在 0 .3～ 4 .5kb之间。结论 长距离cDNAPCR是从微量dscDNA起始材料中获得大量的全长cDNA信息的有效方法。

黄芪对豚鼠Ⅰ型超敏反应的影响

目的 :观察黄芪对豚鼠 型超敏反应早、晚期及细胞因子的影响。方法 :以马血清致敏豚鼠作为 型超敏反应的动物模型。结果 :通过病理观察发现 ,中药黄芪既能抑制毛细血管扩张、通透性增强、腺体分泌增加、平滑肌收缩等超敏反应的早期病理改变 ,也能抑制以嗜酸性粒细胞浸润为主的晚期病理改变 ,效果显著。应用 EL ISA检测 IL- 4、IFN- 在豚鼠血清中的含量。致敏组和实验用药组 IL- 4浓度均值为31.2 2 pg/ m l和 14.40 pg/ m l(P<0 .0 5 ) ,而 IFN- 的均值分别为 10 .32 pg/ ml和 2 3.14pg/ m l(P<0 .0 5 )两者差异均有显著性。结论 :黄芪可能是通过调整了 Th1和 Th2的偏移 ,使 IL - 4分泌减少 ,B细胞合成的Ig E也随之明显降低 ,从而阻止了 型超敏反应的发生。

HSV-1致Hela细胞凋亡的扫描电镜及透射电镜观察

目的 探讨HSV 1感染Hela细胞时 ,是否发生凋亡。方法 用扫描电镜及透射电镜观察感染 72h的Hela细胞的形态变化。结果 正常的Hela细胞表面有丰富的微绒毛。细胞间隔清晰 ,可见幼稚连接 ,连接不紧密。胞浆内线粒体嵴结构完整 ,并可见大量的粗面内质网及游离核糖体 ,极少的脂滴。细胞核内多为常染色体 ,核仁清晰 ,核浆比约 1∶1。凋亡细胞中核内异染色质增多 ,染色质浓缩成块状 ,边集于核膜。线粒体轻度肿胀 ,溶酶体代偿性增多。核膜、胞膜、各细胞器膜均完整。坏死细胞的染色质呈不规则的团块状 ,但不象凋亡细胞那样集中于核周边。细胞膜、核膜和细胞器的结构破坏 ,线粒体空泡变 ,细胞崩解 ,胞浆及其内容物外泄。HSV 1感染的Hela细胞体积明显缩小 ,核浆比例明显增加。细胞表面的微绒毛断裂、减少 ,细胞膜球状突起。核膜完整 ,核致密 ,呈块状分布 ,边集于核膜。细胞膜、细胞器结构完整。可见出泡现象和凋亡小体形成现象。在胞核内可见病毒体。结论 ①HSV 1感染Hela细胞时 ,造成细胞死亡形式是核死亡形式即凋亡 ;②HSV 1感染Hela细胞时 ,细胞凋亡占绝对优势 。

肿瘤特异性抗原基因克隆技术的新进展

肿瘤特异性抗原的获得、鉴别一直是肿瘤免疫研究的热点之一 ,分子生物学技术的飞速发展 ,给这一领域带来了勃勃生机。本文综述了应用分子生物学技术分离肿瘤特异性基因 ,并用免疫学方法鉴定其抗原性 。

电镜观察黄芪对豚鼠I型超敏反应早期反应和晚期反应的治疗作用

目的 :研究黄芪对豚鼠 型超敏反应早期反应和晚期反应超微结构的影响。方法 :马血清致敏豚鼠 1周后 ,黄芪粉稀释液 (2 .7× 10 - 2 g/ kg体重 )胃管给药。 2周后发敏 ,出现典型发敏症状者立即麻醉 ,取十二指肠下段及肺组织作早期反应材料 ,发敏后 5 h仍存活者 ,取上述同样组织做晚期反应材料。结果 :通过透射电镜 (TEM)超微结构的观察发现 , 型超敏反应早期反应中即有典型的平滑肌收缩 ,腺体分必增加 ,毛细血管扩张等功能性障碍 ,还伴有线粒体肿胀 ,嵴断裂、空泡性变 ;肌丝溶解、空泡变 ;小肠上皮细胞微绒毛肿胀 ,断裂、丢失等现象 ;同时早期反应的肠粘膜固有层中有较多的凋亡细胞存在。晚期反应中除有嗜酸粒细胞浸润的炎症外 ,尚有少量纤维渗出及 型肺泡细胞的增生 ,可见 型肺泡细胞的的凋亡。黄芪能明显抑制 型超敏反应的上述早期反应及晚期反应。结论 : 型超敏反应的早期反应除有功能障碍外 ,还有器质性损伤 (坏死和凋亡两种形式 ) ;黄芪对豚鼠

细胞内钙离子螯合剂抑制HSV-1诱导Hela细胞的凋亡作用

目的 :探讨HSV 1在诱导Hela细胞凋亡中 ,细胞内游离钙浓度的变化及钙离子螯合剂对HSV 1诱导Hela细胞凋亡的抑制作用。方法 :HSV 1感染Hela细胞后 ,用扫描电镜及透射电镜观察凋亡情况。用荧光探针标记细胞内游离Ca2 + ,在不同时间观察细胞内游离Ca2 + 浓度的变化。结果 :HSV 1感染Hela细胞后 ,出现了典型的凋亡形态学变化。细胞内游离Ca2 + 浓度在HSV 1感染Hela细胞后 12h达高峰 ;典型的凋亡形态学变化出现在HSV 1感染Hela细胞后 2 4h。细胞内Ca2 +螯合剂能显著抑制HSV 1诱导的Hela细胞凋亡。结论 :细胞内游离Ca2 + 在HSV 1诱导的Hela细胞凋亡过程中 ,具有重要作用 ,此实验结果为临床治疗相关疾病提供了有用的线索。

抑制性消减杂交构建肺腺癌及同源正常组织cDNA文库

目的:分离肺腺癌及同源正常组织中的未知特异性基因片段,并建立相应的cDNA文库,为研究肿瘤基因疫苗打下良好的基础。方法:从肺腺癌及同源正常组织中分别提取总RNA,磁珠分离mRNA并逆转录为dsDNA,经RasI消化酶切将Adaptor-1和Adaptor-2R适配子分别与肺腺癌消化后的cDNA连接(作为tester),再与正常同源组织(作为driver)进行正向杂交和逆向杂交。具有上述2种不同适配子的杂交后cDNA分子,通过初次PCR和巢式PCR富集未知的cDNA片段,此PCR产物与TA克隆载体pGEM连接,转化Top10大肠杆菌,获得白色菌落并经菌液PCR扩增出未知基因片段。结果:经正向抑制性消减杂交和逆向抑制性消减杂交分别获取了肺腺癌组织及同源正常组织的特异性cDNA文库。结论:抑制性消减杂交是一种快速、方便、有效的建立cDNA文库的方法。

单纯疱疹病毒性角膜基质炎的鼠模型建立

目的 建立单纯疱疹病毒性角膜基质炎 (HSK)的鼠模型 ,为研究HSK的发病机制及临床治疗奠定基础。方法 用HSV 1RE株感染Balb c鼠角膜 ,建立HSK的鼠模型 ,并在感染后 1天、3天、7天观察病变。结果 实验组鼠角膜有HSK病变发生 ,而空白对照组鼠角膜上皮愈合、完整光滑。结论 HSV 1RE株感染Balb c鼠有效 ,可致HSK发生。

重楼皂苷Ⅰ抗肝癌细胞作用的初步研究

目的:本文旨在研究重楼皂苷Ⅰ对肝癌细胞株Huh7和HepG2的抑制作用并探讨其是否具有抑制肝癌干细胞的功效。方法:不同剂量的重楼皂苷Ⅰ处理肝癌细胞后,MTT方法检测细胞存活情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Transwell实验检测细胞迁移能力;磁珠分选出CD133+-Huh7和CD133--HepG2细胞后,成球实验检测重楼皂苷Ⅰ对CD133+及CD133-肝癌细胞Huh7和HepG2体外成球能力的影响。结果:重楼皂苷Ⅰ可抑制Huh7和HepG2细胞的增殖能力和迁移能力;诱导肝癌细胞发生剂量依赖性凋亡;磁珠分选和体外成球实验结果显示,重楼皂苷Ⅰ对CD133+-Huh7和CD133+-HepG2肝癌干细胞作用无显著差异,均使细胞变小,细胞形态发生皱缩。结论:重楼皂苷Ⅰ可以抑制肝癌细胞Huh7和HepG2的增殖和迁移,诱导细胞发生凋亡,并不具备明显的杀伤肝癌干细胞的能力。

结直肠癌细胞通过激活成纤维细胞的ERK通路诱导癌症相关成纤维细胞的形成

目的探究结直肠癌(CRC)细胞(HCT116、Caco-2)条件培养基促进癌症相关成纤维细胞(CAFs)形成的机制,为CRC治疗提供新的思路。方法将对数生长期的人正常结直肠成纤维细胞(CCD-18Co)分为对照组、HCT116细胞条件培养基处理组(HCT116-CM组)、Caco-2细胞条件培养基处理组(Caco-2-CM组)、300 nmol/L ERK抑制剂SCH772984组(iERK组)、HCT116-CM联合ERK抑制剂组(HCT116-CM+iERK组)、Caco-2-CM联合ERK抑制剂组(Caco-2-CM+iERK组)。采用RT-PCR和细胞免疫荧光检测CAFs相关分子标志物表达水平;利用RTCA、克隆形成和创伤愈合实验测定细胞增殖、克隆形成和迁移能力;Western blot检测HCT116-CM和Caco-2-CM激活的成纤维细胞信号通路,同时检测相应信号通路阻断后CAFs形成情况。结果HCT116-CM和Caco-2-CM可上调CCD-18Co中CAFs标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、纤连蛋白(FN)和转化生长因子-β(TGF-β)的mRNA表达水平并促进成纤维细胞向CAFs转化(P<0.05)。HCT116-CM和Caco-2-CM促进CCD-18Co细胞的增殖、克隆形成和迁移(P<0.05)。HCT116-CM和Caco-2-CM增强CCD-18Co细胞中α-SMA蛋白的表达和ERK磷酸化修饰水平(P<0.05),ERK抑制剂SCH772984可抑制α-SMA的表达并抑制CRC细胞条件培养基的促CAFs形成作用(P<0.05)。结论CRC细胞可通过激活成纤维细胞的ERK通路诱导CRC相关CAFs的形成。

ULBP4原核表达、生物学功能鉴定及其单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的:在大肠杆菌中表达ULBP4重组蛋白,并制备其特异性的单克隆抗体(mAb),为γδT细胞对ULBP4的识别机制研究奠定基础。方法:根据GenBank中ULBP4的基因序列设计相应的引物,用RT-PCR方法从HO-8910细胞中扩增得到ULBP4片段,构建重组原核表达质粒pET22b(+)/ULBP4(前225aa胞外段),在Rosetta-gamiTMB(DE3)大肠杆菌中获得表达且主要位于包含体中,经纯化透析复性后,分析其对NK细胞IFN-γ细胞因子分泌的影响。以ULBP4为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次经HAT选择培养、间接ELISA法、克隆化培养、荧光免疫检测和流式细胞术以及Western blot筛选和鉴定抗ULBP4 mAb的杂交瘤细胞株。结果:构建了pET22b(+)/ULBP4(225aa)原核表达体系,并检测到重组蛋白的有效表达;纯化的重组蛋白在体外培养体系中可以刺激NK细胞IFN-γ细胞因子的分泌。此外,还获得了4株可稳定分泌抗人ULBP4 mAb的杂交瘤细胞株。结论:成功地构建并表达了具有生物活性的ULBP4,为γδT细胞的识别机制研究建立抗原制备平台,同时所制备的抗人ULBP4 mAb,为后续研究奠定了基础。

重楼皂苷Ⅶ对胰腺癌细胞的作用研究

目的:研究重楼皂苷Ⅶ对胰腺癌Miapaca-2细胞增殖、迁移及凋亡的影响。方法:不同浓度的重楼皂苷Ⅶ处理胰腺癌细胞后,高内涵筛选(High-content screening,HCS)分析细胞数量、面积、迁移速度、圆度的变化;MTT法检测细胞存活能力;平板克隆技术检测细胞增殖能力;划痕实验和Transwell观察重楼皂苷Ⅶ抑制细胞的迁移能力;DAPI染色和流式细胞术检测细胞形态和凋亡情况;成球实验检测重楼皂苷Ⅶ对Miapaca-2干细胞的抑制情况;Real-time PCR检测重楼皂苷Ⅶ处理Miapaca-2干细胞标志物CD133的表达情况。结果:MTT结果显示重楼皂苷Ⅶ能明显抑制胰腺癌Miapaca-2细胞的活力,呈剂量依赖关系;重楼皂苷Ⅶ对胰腺癌细胞迁移、侵袭有一定的抑制作用;DAPI染色发现随着药物浓度升高,细胞形态发生明显变化,出现核固缩;流式结果表明细胞凋亡率随重楼皂苷Ⅶ浓度增大而逐渐升高;重楼皂苷Ⅶ可抑制Miapaca-2的成球能力;同时可导致Miapaca-2干细胞标志物CD133的表达降低。结论:重楼皂苷Ⅶ在体外可以抑制胰腺癌Miapaca-2细胞的增殖、迁移和侵袭能力,诱导细胞发生凋亡,并且抑制胰腺癌干细胞的增殖及干细胞标志物CD133的表达。

钛合金压阻式压力传感器玻璃烧结基座的制备及工艺研究

钛合金具有比强度高、耐高温、耐腐蚀等优良特性,以其作为外壳的传感器在恶劣环境下的工作能力远优于不锈钢作为外壳的传感器。基于钛合金的上述特性,首先系统地研究了钛合金压阻式压力传感器玻璃烧结基座的制备工艺,针对制备过程中表面处理及镀金后烧结基座存在的气密性差、绝缘电阻不良等问题进行了分析与讨论,并给出了解决方案,最终生产出了满足客户要求的产品。

基于GEO数据库筛选阿尔茨海默病的关键基因

目的 应用生物信息学方法筛选阿尔茨海默病的关键基因。方法 从GEO数据库下载GSE5281和GSE138260数据集,用R语言对数据集进行去批次效应;WGCNA分析构建共表达网络,筛选与疾病相关基因模块并绘制基因聚类图和相关性图;以WGCNA筛选出的模块基因为对象进行差异表达基因分析,绘制火山图及热图;对差异表达基因进行Lasso回归分析,筛选关键基因;对差异表达基因进行京都基因和基因组数据库(KEGG)和基因本体(GO)富集分析,绘制气泡图。结果 通过WGCNA分析获得包含704个基因的brown模块与疾病高度相关;brown模块差异表达分析得到39个差异表达基因,其中10个下调基因,29个上调基因;进一步Lasso回归后筛选出9个关键基因。GO和KEGG富集分析表明,差异表达基因在矿物质元素的吸收、氧化还原驱动的活性跨膜转运蛋白等方面富集。结论 GEO数据库初步筛选出潜在的阿尔茨海默病关键基因,但还需进一步实验验证。