酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶活性测定方法的研究

目的建立标准的酵母双杂交系统报告基因表达的β-半乳糖苷酶活性测定方法。方法采用o-硝基-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,以液氮反复冻融破碎酵母细胞壁,通过比较不同测定时间、接种阳性克隆数目、转化方法以及酵母株对β-半乳糖苷酶酶活的影响,确定最佳酶活测定条件。结果相同条件下,单个克隆之间的酶活有差异,相对标准偏差(RSD)>8%;相同条件下,Y187酵母株比AH109酵母株酶活高18～20倍,并且本底水平很低甚至没有;双倍体酵母的酶活介于两个单倍体酵母之间,同预计一致;质粒顺序转化与共转化在AH109中差异有统计学意义(P<0.001),而在Y187中没有明显差异(P>0.05)。结论测定酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶的活性宜采用Y187酵母株,酶活变化范围大,本底小,受转化方法影响小,测定时选取5个以上阳性克隆混合培养更有利于酶活的准确测定。

RP-HPLC法测定大鼠血清中龙胆苦苷的含量

目的 建立一种测定大鼠血清中龙胆苦苷含量的方法。方法 针对化合物的理化性质 ,采用固相萃取小柱对样品进行测定前的预处理 ,然后以甲醇 -水 (30∶ 70 )为流动相于高效液相色谱仪上定量 ,检测波长 2 70nm。结果 方法学考察结果显示 ,线性范围为 0 .5～ 15 6 .2 mg· L-1,且相关系数良好 (r =0 .9994 ) ,高、中、低浓度样品的回收率分别为 83.5 % ,81.9% ,84 .9% ,检测限小于 0 .13mg· L-1。结论 此方法操作简便 ,可作为一般药理学研究测定血清中龙胆苦苷浓度的方法 。

反相高效液相色谱法测定大鼠血浆中龙胆苦苷的含量

建立了一个测定大鼠血浆中龙胆苦苷含量的方法 ,方法学考察结果显示 ,此方法操作简便 ,精密度和回收率均较高 ,线性范围宽且相关性好 ,可作为一般药理学研究监测大鼠血浆中龙胆苦苷浓度的手段 ,也可为临床测定人血浆中该药的浓度提供参考。

宁溃灵的药理学研究

宁溃灵是治疗消化性溃疡的有效方剂 ,具有稳急止痛 ,理气消胀 ,健脾和胃 ,生肌愈疡的功效。我们的试验表明 :宁溃灵的最大给药量为 1 1 7.7g/kg/d(生药 ) ,相当于人日用量的 2 74.62倍。宁溃灵对醋酸形成的慢性胃溃疡大鼠 ,可显著的促进胃溃疡的愈合 ,并可降低其升高的胃蛋白酶活性。宁溃灵有轻微的促进胃肠运动作用 ,可轻微的加快小鼠对碳墨的推进速度。宁溃灵对由冰醋酸导致的腹痛 (扭体反应 )有明显的抑制作用 ,对热刺激引起的疼痛 (小鼠甩尾反应 )有抑制作用。

白茅根多糖的提取与含量测定

目的优化白茅根多糖的提取工艺并对其含量进行测定。方法以白茅根多糖得膏率为考察指标,采用正交试验法对提取过程中的温度、次数、时间及料液比四因素进行优选研究,采用苯酚-浓硫酸法测定多糖含量。结果提取次数对多糖提取的影响最显著,其次是提取温度,提取时间和用水量对其影响较小。结论白茅根多糖的最佳提取工艺条件是用15倍水量在85℃温度下回流提取3次,每次水提取时间为3h。两产地的多糖含量均在0.15%以上。

蒺藜草中一个新的六糖甾体皂甙结构的NMR研究

从蒺藜草中分离得到一个新的六糖甾体皂甙,利用ＮＭＲ方法,特别是２ＤＮＭＲ技术,确定了它的化学结构为３－Ｏ－{β－Ｄ－吡喃木糖基－(１→３)－[β－Ｄ－吡喃葡萄糖基－(１→２)]－β－Ｄ－吡喃葡萄糖基－(１→４)－[α－Ｌ－吡喃鼠李糖基－(１→２)－β－Ｄ－吡喃半乳糖基}－２２－甲氧基－２６－Ｏ－{β－Ｄ－吡喃葡萄糖基}－蒺藜基皂甙元．

过氧化作用与肝脏疾病

肝脏疾病中,过氧化通常被定义为强氧化复合物和抗氧化防御之间的不平衡,过量的过氧化产物是肝脏疾病的重要标志物.活性氧是一种机体代谢反应的活性产物,他可以造成很多细胞内分子如膜脂、蛋白和DNA损伤.氧化作用在肝脏疾病发病机制中有着重要意义.本文总结氧化作用自由基的特点以及部分抗氧化剂的特性,并且讨论了氧化作用产物在肝脏疾病中的重要意义.

MAPK信号通路基因在小鼠肝再生中的表达谱变化

为了分析丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases,MAPK)信号通路基因在肝再生中的表达图谱,以及探讨MAPK信号通路在肝再生中的作用,文章利用四氯化碳(Carbon Tetrachloride,CCl4)诱导的小鼠肝损伤再生模型对MAPK信号通路基因的表达进行检测。首先,采用CCl4腹腔注射的方法建立小鼠肝损伤再生模型,通过肝脏切片HE染色和测定血清中谷丙转氨酶活性确认模型的质量,然后,在注射CCl4后的第0、0.5、1.5、4.5、7d分别采集小鼠肝脏样本,应用Affymetrix公司的小鼠基因表达芯片,检测MAPK信号通路中93个基因的差异表达图谱,并用荧光实时定量PCR法验证芯片检测的结果。结果表明,在芯片检测到的93个MAPK信号通路基因中,有31个在肝再生中有不同程度差异表达,且经荧光实时定量RT-PCR检测的结果与基因芯片的结果相符合。基因表达谱芯片技术可以筛选出肝再生中差异表达的基因,在小鼠肝再生中的第0.5和1.5d,MAPK信号通路中表达水平上调的基因增多,而在第4.5和7d,则表达水平下调的基因明显增多。这一结果表明MAPK信号通路对肝再生不同阶段的双重调控作用。

白头翁皂苷B4体外抑制人肝癌细胞HepG2增殖并诱导其凋亡

目的筛查中药白头翁抗肝癌有效成分,探索其抗癌机制。方法分离白头翁皂苷成分,以人肝癌细胞HepG2为作用靶细胞,MTT法测定其对细胞增殖的抑制,流式细胞术检测细胞周期阻滞,DNA片断化方法检测细胞凋亡情况,检测半胱氨酸蛋白酶3酶活性,从信号通路的角度探寻其诱导凋亡的机制。结果白头翁药材含量较高的成分白头翁皂苷B4对HepG2具有显著的抑制作用,最大抑制率达到71.5%;通过细胞周期分布分析,发现最多有83.2%的细胞被阻滞在G2期;用流式细胞仪研究其凋亡情况发现,在40 mg/mL药物浓度作用下,细胞凋亡与孵育时间呈现依赖关系,随着时间从0到48 h,初期凋亡比例从接近于零最高增长到14.3%,并且发生了DNA片段化;进一步研究发现,白头翁皂苷B4处理后的HepG2细胞半胱氨酸蛋白酶3活性显著升高。结论白头翁皂苷B4调控肝癌细胞周期,阻滞G2/M期更替,诱导细胞凋亡,是肝癌治疗的潜在候选分子,奠定了白头翁药材用于肝癌治疗的理论基础。

蛋白质相互作用及互作网络的生物信息学分析

后基因组时代的最终目标是认识真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物学功能,即蛋白质组学研究。关键的挑战之一就是对蛋白质相互作用网络的研究,将有助于从系统角度加深对细胞结构和功能的认识,并且为新药靶位点的发现和药物设计提供理论基础。目前,用生物信息学的手段来研究蛋白质相互作用网络显示出巨大的优势,主要包括蛋白质相互作用网络的绘制与显示、网络的拓扑结构分析、网络结构模块的研究及网络的比对等。文章试图从生物信息学的角度认识蛋白质相互作用,并总结蛋白质相互作用网络的生物信息学分析方法。

龙胆苦苷在大鼠体内的组织分布研究

目的研究龙胆苦苷在大鼠体内的组织分布。方法采用固相萃取(SPE)、高效液相色谱(HPLC)联用检测大鼠组织中龙胆苦苷的含量。结果大鼠在120mg/kg肌肉注射龙胆苦苷后,该药可很快在体内分布,大多数组织在3.5min即达到较高浓度,其中肾脏浓度较高,脑组织中测不到药物的存在。结论该药似不能通过血脑屏障进入脑组织。在所研究组织中,尚未见有明显的特殊蓄积现象。

白茅根中绿原酸的提取与含量测定

目的:筛选最佳的白茅根中绿原酸的提取条件,建立药材中绿原酸含量的测定方法。方法:通过3水平、4因素正交实验方法确定白茅根中绿原酸提取的最佳条件,采用高效液相法测定其含量。结果:提取最佳条件为:提取次数为2次,料液比为1:30,90℃甲醇做溶剂,超声时间为40分钟。HPLC含量测定方法的最佳条件为:以乙腈-0.4%磷酸(13:87)为流动相,流速1.0ml.min-1,检测波长328nm,其中绿原酸在0.2～3.2μg范围内呈线性关系,线性方程Y=2×106X-59372,r=0.9998,精密度、重复性、回收率试验结果均比较理想,RSD分别为:0.95%、1.83%、4.73%。结论:以料液比1:30,90℃提取两次能够有效地提取绿原酸;HPLC方法检测绿原酸准确,重现性好,结果可靠。

小鼠肝再生过程中脂质代谢相关通路中基因的表达谱变化(英文)

1材料与方法 1．1材料 试验动物：9周龄的雄性C57BIV6小鼠，自由采食和饮水，每天光照12h，黑暗12h。试剂：TRIzol试剂（Invitrogen）；RNeasy Total RNA Mini Kit（Qiagen）；基因芯片Genechip mouse genome 43020（Affymetrix）；17启动子引物序列（Affymetrix）。

小鼠肝再生过程中脂质代谢相关通路中基因的表达谱变化

[目的]研究肝再生过程中肝脏内脂质代谢通路相关基因的表达谱变化。[方法]建立CC l4诱导肝再生小鼠模型,从小鼠肝组织中提取总RNA,通过微阵列基因芯片技术检测在不同肝再生期间脂质代谢通路相关基因的表达变化,并进行具体功能分析。[结果]肝再生过程中,有98个脂质代谢相关基因的表达水平发生了变化,根据这些基因表达的变化趋势可以分为8组。整体上看,基因表达前期表现为抑制,后期表现为上调。其中,脂肪酸的合成通路基因表达以上调为主,分解代谢通路变化并不明显;大多数胆汁酸合成通路基因在4.5天之前表现为抑制,在4.5天和7天时表现为上调。[结论]肝再生过程中,脂质代谢相关通路间的基因表达变化并不一致,这些数据为进一步研究脂质代谢相关通路对肝再生的调控作用提供了明确的基因范围。

金银花中绿原酸和木犀草苷的同时提取及测定研究

目的:优化金银花样品中绿原酸和木犀草苷提取工艺,并建立两者含量同时测定的方法。方法:设计三水平四因素的正交试验,筛选最佳提取条件,并以此条件处理不同产地的金银花,用HPLC测定其绿原酸和木犀草苷的含量。结果:最佳提取工艺条件为:用50%的乙醇35mL在70℃下回流提取1h;0.5%冰醋酸和甲醇为流动相,梯度洗脱,检测波长350 nm,绿原酸和木犀草苷的线性方程y=1×106x-806 7和y=4×106x-119 017,线性区间为:0.2～1.6μg和0.22～2.2μg,回归系数r值为0.999 9和0.9997;精密度、稳定性、回收率试验结果均良好;五个产地的金银花有四个绿原酸和木犀草苷的含量高于药典规定。

酸乳中乳酸细菌的分离及酸乳制作工艺的探讨

叙述了从市售酸乳中分离获得乳酸杆菌和乳链球菌的实验过程以及用分离获得的乳酸杆菌、乳链球菌来制作酸乳的生产工艺 ,并将试制的不同浓度的酸乳进行了营养检测 .

HPLC法测定白头翁中皂苷B4含量及其中药材标准化研究

目的:建立HPLC测定白头翁药材中白头翁皂苷B4含量的方法,并比较不同产地、不同生长年份对白头翁皂苷B4含量的影响,以评价白头翁药材质量。方法:HPLC流动相:乙晴∶水(28∶72);流速:1.0 mL/m in;分离柱采用ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm),反相填料;柱温:室温;检测波长:205 nm。结果:皂苷B4进样量在0.312 5-10μg范围内与吸收峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 5,n=6),平均加样回收率为99.74%,RSD=3.28%(n=3)。结论:该方法简便、准确、重现性好,可用于白头翁皂苷B4的含量测定;白头翁中皂苷B4含量以安徽凤阳产药材较高,可作道地药材。

酵母双杂交研究小鼠肝脏再生TGF-β调控通路中相关转录因子的相互作用

目的采用酵母双杂交系统研究肝脏再生调控途径转化生长因子β(TGF-β)信号通路中4种转录因子的相互作用。方法经CCl4腹腔注射诱导建立小鼠肝损伤再生模型,提取模型小鼠肝脏组织总RNA作为模板,经RT-PCR获得cDNA。经肝脏再生基因芯片检测显示差异表达且与TGF-β信号通路相关的激活转录因子3(ATF3)、DNA结合抑制因子3(ID3)、DNA损伤诱导的转录因子3(DDIT3)和LIM蛋白家族成员FHL2(FHL2)作为候选基因,进行基因克隆和载体构建,PCR及DNA测序鉴定。采用酵母双杂交系统进行自激活检测实验和酵母双杂交实验,观察ATF3、FHL2、DDIT3和ID3之间的相互作用。结果 PCR及DNA测序鉴定表明,ATF3、FHL2、DDIT3、ID3基因克隆与载体构建成功。自激活检测显示ATF3、FHL2、DDIT3和ID3不存在自激活现象;酵母双杂交实验发现7对蛋白互作,分别为ID3/ATF3、FHL2/ATF3、ATF3/ATF3、FHL2/FHL2、ID3/FHL2、ID3/ID3和ID3/DDIT3。结论 ATF3、FHL2和ID3间的蛋白互作可能对TGF-β信号通路具有调控作用;蛋白互作网络可作为肝损伤再生机制研究的途径之一。

右旋糖酐铁注射液中右旋糖酐铁峰位相对分子质量的测定

目的:建立测定右旋糖酐铁注射液中右旋糖酐铁峰位相对分子质量(Mp)的方法,以评价2种注射液的质量差异。方法:色谱柱为TSKG4000SW凝胶柱(7.5mm×30.0cm),保护柱为TSKgelSWguardcolumn(7.5mm×7.5cm);流动相为0.1%叠氮化钠水溶液,流速为1.0mL·min-1;柱温和检测器温度为30℃。以已知Mp的右旋糖酐为标样,拟合计算右旋糖酐的Mp工作曲线,并经已知Mp的右旋糖酐铁对照品校正,进一步拟合计算右旋糖酐铁的Mp。结果:注射液A右旋糖酐铁Mp较小,平均为1.53×105;注射液B右旋糖酐铁Mp较大,平均为4.26×105。结论:建立了右旋糖酐铁的峰位Mp的测定方法,2种注射液中右旋糖酐铁的Mp相差较大,反映了注射液的质量差异。