猪缝隙连接蛋白43(GJA1)结构和功能的预测与分析

为了探究猪缝隙连接蛋白43(GJA1)的结构和相关功能,本研究对16个哺乳动物的GJA1蛋白进行多重序列比对及系统发育分析,并通过相关的生物信息学数据库和软件从理化性质、蛋白修饰位点、跨膜区、亚细胞定位、二级结构、三级结构、多态位点、功能区域和互作蛋白等方面对猪GJA1蛋白的结构和功能进行系统分析。系统发育分析结果显示,GJA1蛋白在16种哺乳动物中变异未达到饱和,物种间遗传距离小且同源性高,其中猪与马的GJA1蛋白序列最为接近,同源性达93.3%,在进化树上的分类也证实了这一结果。蛋白结构分析结果显示,猪GJA1蛋白分子质量为43.08ku,理论等电点为8.88,由20种氨基酸组成,不稳定指数为44.06,平均疏水系数为-0.240,脂溶指数为82.67,不分泌信号肽,有4个跨膜区、6个O-糖基化位点和38个磷酸化位点,最有可能位于细胞质膜和高尔基体内,其二级结构和三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。蛋白功能分析结果显示,在猪GJA1蛋白的CDS序列中有2个超级家族结构功能区域和6个错义突变位点,且猪GJA1蛋白还与ZO-1和Cx36等蛋白及多种蛋白激酶存在相互作用。本研究通过生物信息学分析系统地揭示了猪GJA1蛋白的结构和功能,为后续进一步研究GJA1蛋白在猪体内发挥生物学功能的遗传调控机制提供一定的理论支持。

猪m^(6)A甲基化酶WTAP基因与F18大肠杆菌感染的关系

本研究旨在探讨猪m 6A甲基化酶WTAP表达水平与大肠杆菌(E.coli)感染抗性的关系。选取35日龄苏太断奶仔猪(Sus scrofa)大肠杆菌抗性型和敏感型个体各4头,采集十二指肠和空肠组织,利用RT-qPCR检测WTAP在E.coli抗性型和敏感型个体十二指肠、空肠的表达差异,并分别利用产肠毒素大肠杆菌(F18ab、F18ac)刺激和内毒素(LPS)诱导猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),检测WTAP基因的表达变化。同时构建WTAP基因干扰载体并转染IPEC-J2细胞,通过菌毛定量、菌落计数以及间接免疫荧光试验检测该基因沉默对大肠杆菌黏附能力的影响。结果显示:在十二指肠和空肠组织中,WTAP基因在E.coli抗性型个体中的表达量显著高于敏感型个体(P<0.01);并且在F18ab和F18ac刺激后表达量显著下降,与LPS诱导6 h后结果相一致(P<0.01)。沉默WTAP基因后,大肠杆菌黏附能力极显著上升(P<0.01)。本研究在细胞和个体水平上验证发现,m 6A甲基转移酶WTAP的高表达可能有助于仔猪抗大肠杆菌感染,为进一步揭示仔猪抗大肠杆菌感染的RNA甲基化调控机制奠定基础。

CRISPR/Cas9介导TLR5敲除猪肺泡巨噬细胞系建立及对革兰阴性菌黏附能力的影响

Toll样受体5 (TLR5)是Toll-like受体家族中的重要成员,在革兰阴性菌引起的炎症反应中发挥着重要的调控作用。通过CRISPR/Cas9基因敲除技术对猪肺泡巨噬细胞(PAMS)的TLR5基因进行敲除,然后经菌落计数,检测TLR5基因敲除后对大肠埃希菌F18ab和F18ac以及沙门菌黏附能力的影响。结果表明:设计的2条sgRNAs成功插入CRISPR/Cas9载体中,序列正确,转染猪肺泡巨噬细胞后均能稳定表达,且PCR测序峰图出现套峰,表明敲除载体具有切割活性。利用有限稀释法,最终获得1株缺失15个碱基的单克隆细胞系TLR5-sg1。对TLR5敲除细胞进行qPCR和Western blot验证,结果显示TLR5基因的转录水平极显著下调,其蛋白质水平也明显降低。细菌黏附试验结果显示,TLR5敲除细胞中黏附的大肠埃希菌F18ab、F18ac和沙门菌(ATCC13312)的数量均极显著低于对照组。这一研究成功建立了猪TLR5基因敲除的3D4/21细胞系,且TLR5基因的敲除会降低大肠埃希菌和沙门菌对3D4/21细胞的黏附能力,为进一步探究TLR5基因的生物学功能建立了细胞模型,为深入探讨TLR5基因在炎症反应中的免疫调控作用提供了试验素材。

梅山猪PBD-1基因CDS区克隆、组织表达及生物信息学分析

为系统探究猪β防御素-1(PBD-1)基因的结构和功能,以梅山猪为试验材料,扩增PBD-1基因CDS区,应用生物信息学分析猪PBD-1基因编码蛋白的特性和功能,运用DnaSP和MEGA分析猪PBD-1基因与其他物种进化关系,同时利用实时荧光定量方法检测PBD-1基因在梅山猪不同组织中的表达水平。结果表明:猪PBD-1基因CDS区长195bp,编码64个氨基酸,为脂溶性疏水性、不稳定的分泌型蛋白,无跨膜结构,存在信号肽区域(第1～22位氨基酸);该蛋白存在3个特异性蛋白质激酶的结合位点(PKC、PKA、UNSP),二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;包含defensin-beta保守结构域(第28～62位氨基酸),且该蛋白可能与PBD-2、CCR6、NPG1、PAMP-23、ZCCHC3等蛋白存在相互作用关系。进化分析显示,猪PBD-1基因与驴、驯鹿具有较高的同源性,可聚为一类。组织表达谱显示,PBD-1基因在梅山猪不同组织中均有表达,尤其在胃、免疫组织(胸腺、淋巴)及肠道组织(空肠、回肠)中呈现高表达。这一研究为今后深入研究PBD-1基因功能提供了理论参考。