产碱杆菌Alcaligenes sp.KS-85来源肌酸酶活性中心的关键氨基酸功能研究

肌酸酶(Creatinase,EC 3.5.3.3)水解肌酸生成尿素和肌氨酸,是肌酐多酶级联检测中的关键酶。为进一步解析产碱杆菌来源肌酸酶的催化机理,利用蛋白质同源建模、分子对接、丙氨酸扫描技术分析了酶与底物的相互作用,并聚焦于酶活性中心4个功能未知的保守位点Phe64、Asp102、Phe252、Phe321,通过将氨基酸残基定点突变为6种具有代表性的氨基酸,结合生化实验对其功能进行解析。经研究,所有突变体的kcat值大幅度降低;除6个突变体:F252A、F252S、F252Y、F252W、F321A、F321Y的KM值降低,其余突变体的KM均提高。结构分析表明Phe252通过与Tyr259形成的π-π堆积稳定酶-底物复合体;Asp102通过与Arg66,Gly322的氢键相互作用稳定酶反应的过渡态;Phe321,Phe64位于底物两侧,通过疏水侧链的排斥作用及空间位阻影响底物的定位。本研究通过对活性中心氨基酸残基的功能解析,为肌酸酶的催化机制解析和分子改造奠定了基础。

香菇多糖的提取工艺研究

采用热水法浸提香菇多糖,按照原料处理、烘干、粉碎、称样配比、热水浸提、抽滤、离心、纯化、浓缩、醇提、定容、稀释、苯酚-硫酸法测量、吸光度测量,然后以葡萄糖作为标准品计算香菇多糖得率的工艺流程。在控制单因素的情况下,分别探讨提取时间、提取温度、料液比及提取次数对香菇多糖提取率的影响,测得香菇多糖提取的最佳提取时间3 h、最佳提取温度85℃、最佳提取料液比1∶30、最佳提取次数3次。通过正交试验测得在多因素影响下香菇多糖提取的最佳工艺组合为提取温度85℃、料液比1∶30、提取时间2 h、提取次数1次,提取率达5.61%。该方法容易操作、准确、灵敏度高,是一种无污染而且花费较少的香菇多糖提取工艺。

常用逻辑用语错解“串烧”

我们知道,常用逻辑用语是一种数学语言,它与我们平时的生活实际用词之间存在一定的联系,但也有很大的区别,如果我们忽视这些区别,就会在学习常用逻辑用语时犯错。那么在用常用逻辑用语解题时,哪些误区我们必须要加以提防呢?误区一:书写四种命题时分不清条件与结论例1写出下列命题的逆命题:(1)对顶角相等;(2)已知ab>0,若a<b,则1/a<1/b。错解:(1)相等对顶角;(2)若1/a<1/b,则ab>0,a<b。

物理概念教学中思维转化的应用

高中物理教师在物理教学方面能够及时地、辩证地适应新的教育理念．改变物理概念教学观念，注重概念教学的过程和方法。在高中一些物理概念教学过程中，经常发现一些学生将某些物理量的概念与其他概念相互混淆，不能对概念形成有效的、正确的认知。针对这一现象提出充分利用实验的优势和精细化的设计对物理概念进行思维转化，提高概念教学的效果。

半理性设计提高产碱杆菌KS-85来源的肌酸酶催化活性

肌酐水平是指示肾脏功能的重要临床指标。肌酸酶(creatinase,CRE)是肌酐的酶促检测体系中的关键酶之一,也是整个体系的限速酶,较差的活性限制了它在临床检测和工业上的应用。针对此问题,采用半理性设计策略对产碱杆菌属(Alcaligenessp.)KS-85来源肌酸酶Al-CRE的活性进行了改造,通过对挑选出的突变热点进行饱和突变筛选和组合,最终获得多个活性提升的突变酶,活性最高的五点突变酶I304L/F395V/K351V/Y63S/Q88A比活力相较于野生型提升了2.18倍。同时对相关突变位点进行了结构分析,为肌酸酶的实际应用及对其机理的进一步解析提供了基础。

鞘糖脂内切糖苷酶的半理性设计

[目的]对鞘糖脂内切糖苷酶EGCaseⅡ进行半理性设计,获得高水解活性突变体。[方法]用半理性设计方法进行突变库设计,利用HPLC对突变库进行筛选,随后对阳性突变体进行动力学及底物谱表征,并利用结构建模对活性提高的分子机制进行解析。[结果]获得了对鞘糖脂GM1、GM3水解活性提高的突变体S63G/D311E、I276L/D311V,活性分别提高为野生型的25.3倍、11.8倍。酶动力学表征显示,S63G/D311E的K_M由0.17 mmol/L降低到0.06 mmol/L,kcat由5.5 min^(-1)增大到50.3 min^(-1)。酶-底物复合物模式结构分析表明,D311E、D311V、I276L这几种突变更有利于酶与底物结合,从而提高酶活性。[结论]通过半理性设计成功获得对GM1和GM3水解活性分别提高25.3倍和11.8倍的EGCaseⅡ突变体。