特异性CTL胞毒作用与HLA型别关系探讨

目的 探讨特异性CTL胞毒作用与靶细胞的HLA型别关系。方法 本实验以特定HLA型别、EB病毒转化的B淋巴母细胞（EBV-LCL）与同种异体单个核细胞（PBMC）混合培养,激活同种抗原特异性细胞性T细胞（CTL）;观察其对携带不同HIA型别的EBV-LCL靶细胞的杀伤活性。结果 用EBV-LCL1致敏的效应细胞1对EBV-LCL2的杀伤效应比对EBV-LCL3强;用EBV-LCL2致敏的效应细胞2对EBV-LCL1的杀伤效应比对EBV-LCL3强;用EBV-LCL3致敏的效应细胞3对EBV-LCL1、2几乎无杀伤效应。结论 特异性CTL对不同HLA型别的靶细胞的胞毒作用存在差异,这不仅仅与HLA型别关联,而可能取决于抗原肽与MHC所组成的抗原综合信息。

建立预测同种异体间组织相容性细胞模型

目的 :建立了预测受、供者间组织相容性信息的体外实验模型 ,探讨了借助此模型预测的组织相容性与BMT术后GVHR发生时间的相关性及其与小鼠移植皮肤存活时间的相关性。方法 :借助所建立的实验模型和细胞模型预测供、受者间组织相容性差异。结果 :①显示其与BMT术后GVHR发生时间呈一定相关性 ,即实验模型检测的受、供者间杀伤活性比值愈大 ,GVHR发生时间愈晚 ;②显示其与同种异体小鼠皮肤移植物存活时间呈正相关 ,即实验模型检测的供、受者间杀伤活性比值愈大 ,小鼠皮肤移植物存活时间愈长。结论 :该模型对选择组织兼容性的移植物供者和判断移植术的预后 ,提供了实验依据和研究线索。

HBc-HLA-A＊ 1101-β2m复合物单体及其四聚体的制备和鉴定

目的制备HBc-HLA-A ＊ 1101-β2m复合物单体和四聚体,并对其特异性进行了鉴定。方法原核高效表达的HLA-A ＊ 1101-BSP和β2m蛋白,在抗原肽（乙型肝炎病毒的核心蛋白HBc88-96）的存在下,体外复性折叠成可溶性的HLA-A ＊ 1101抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体;然后将此复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成四聚体;最后用流式细胞仪检测分析该四聚体结合特异性CTL的能力。结果Western blot和Dot-ELISA检测显示所制备的HLA-A ＊ 1101抗原肽复合物单体具有天然构象,且可被生物素化;流式细胞仪分析显示所制备的四聚体可与HLA-A11^＋供者的抗原特异性CTL结合。结论成功制备了具有完整构象的生物素化HLA-A ＊ 1101抗原肽复合物单体;此四聚体可以特异检测抗原特异性的细胞毒性T细胞。

不同种雏鸭建立鸭乙肝病毒感染模型及抗病毒效果的实验

目的探讨不同种雏鸭建立鸭乙肝病毒感染模型的影响因素,观察应用该模型抗病毒的效果。方法采集鸭血清,应用PCR方法定性检测鸭血清中病毒DNA;定量PCR方法检测鸭血清中病毒DNA载量变化;用抗病毒药物处理,观察其在鸭DHBV感染模型中的抗病毒效果。结果不同种鸭DHBV自然感染率不同,樱桃谷鸭为8.75%,湖北麻鸭两个批次分别为17.80%和10.68%;静脉注射和腹腔注射两途径均能致雏鸭感染DHBV,静脉注射感染率80%,腹腔注射感染率65%;鸭感染DHBV后,体内病毒载量维持在106～108copies/mL,可持续20 d以上;抗病毒药物处理后,在不同DHBV模型中其抗病毒效果变化趋势一致。结论鸭的种类和人工感染途径可影响DHBV感染率;雏鸭感染DHBV后其体内有持续性的病毒血症;DHBV感染模型是药物抗病毒研究较好模型。

人ISG20基因的克隆、真核表达及其抗HBV效应的初步研究

目的:克隆、体外真核表达ISG20基因并研究其抗乙肝病毒效应。方法:应用RT-PCR的方法从Hela细胞中扩增ISG20基因,构建HA-ISG20融合蛋白真核表达载体(pHA-ISG20),分别转染HepG2和HepG2·2·15细胞。Western blot检测HA-ISG20融合蛋白在HepG2细胞中的表达;ELISA方法检测转染和未转染pHA-ISG20的HepG2·2·15细胞中HBs抗原和HBe抗原的表达情况。结果:①克隆了ISG20基因,经测序与Genebank公布序列一致;②HA-ISG20融合蛋白真核表达载体经转染可在HepG2细胞中瞬时表达;③HA-ISG20融合蛋白可抑制HepG2·2·15细胞中HBs抗原和HBe抗原的表达。结论:初步证实ISG20蛋白产物可能具有抗HBV的效应。

乙肝病毒蛋白抗原表位特异性CTL体外扩增条件优化

目的优化乙肝蛋白抗原表位特异性CTL体外扩增条件。方法选择急性自限性HBV感染者外周血,分离PBMC,体外用乙肝蛋白抗原表位多肽特异性刺激,特定天数后收集细胞,用CD8抗体与MHC-I类分子HBV抗原肽四聚体进行染色流式检测,检测扩增后乙肝蛋白抗原表位特异性CTL在CD8阳性细胞群中所占的频率。结果1)在不同多肽浓度刺激下,当浓度在20 ug/mL时,所测得特异性CTL占PBMC中CD8+T细胞的频率达到最高峰;2)固定刺激多肽浓度,在不同的刺激天数获得的特异性CTL频率第10天时最高;3)在不同的细胞因子培养条件中,当加入的细胞因子IL-2,IL-7,IL-15组合时所获得的特异性CTL频率最高。结论在刺激肽浓度为20μg/mL,并加入适量的细胞因子(IL-2,IL-7,IL-15),刺激10天的条件下,所获得的乙肝蛋白抗原特异性CTL频率最高。

HLA-E的结构和功能研究进展

HL A - E分子是一类非经典 HL A- 分子。其提呈的抗原肽主要是经典的 HL A- 类分子及某些 HL A - G亚类分子的信号肽 ;通过与细胞表面的 CD94/ NKG2类受体结合 ,可抑制或激活 NK细胞的生物学活性 ;在肿瘤、病毒感染的逃避机制中可能起重要作用。本文对 HL A- E分子的结构特点、生物学功能研究进展作一综述。

直接识别机制的研究进展及其启发

同种异体间的移植因供、受者组织相容性抗原的不同将发生移植排斥反应 ,主要包括急性排斥反应和慢性排斥反应。其中急性排斥反应中所涉及到的直接识别机制一直是移植免疫学基础研究的热点 。

乙肝病毒感染不同阶段抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞的初步研究

目的:为了阐明HBV感染不同阶段机体免疫功能的不同。方法:分别构建了我国最高频等位基因HLA-A*0201三种常见抗原肽表位(HBVcore18-27、pol575-583、env335-343)四聚体复合物,并用这些四聚体检测HBV感染外周血单个核细胞(PBMCs)中HLA-A*0201限制性抗原特异性CD8^+T细胞的频率、功能及CD127的表达。结果:在大多数自限性HBV感染者的PBMCs中抗原特异性CD8^+T细胞的频率和增殖能力都高于慢性HBV感染者。在低病毒载量的免疫低复制期抗原特异性CD8^+T的数量和在高病毒载量、肝脏损害免疫清除期及免疫耐受期抗原特异性CD8^+T细胞频率是相似的,同病毒定量及ALT水平无显著相关性。慢性HBV感染者抗原特异性CD8^+T细胞增殖能力和病毒滴度呈反比。在自限性HBV感染患者抗原特异性CD8^+T细胞分泌IFN-γ的功能明显高于慢性HBV患者,在免疫耐受期基本丧失产生细胞因子的能力;HBV感染后不同免疫状态的HBs Ag水平不同,免疫耐受期最高,其次为免疫清除期、再活动期,低复制期的最低。而且随着HBs Ag水平下降,同HBV DNA的相关性也逐渐下降。慢性HBV感染者中CD8^+CD127^+T细胞要低于对照组及自限性感染组,特别是在HBe Ag阳性的免疫耐受期及免疫清除期组患者中CD8^+CD127^+T细胞比例更低。结论:慢性HBV感染中抗原特异性CD8^+T细胞的频率不是决定免疫应答的唯一因素,慢性乙肝患者体内记忆性的抗原特异性CD8^+T细胞并未被完全清除或缺失,这为治疗性疫苗和免疫恢复治疗提供了可行性。

HCV核心蛋白抑制干扰素α诱导的抗病毒基因表达及其机制研究

研究HCV核心蛋白对干扰素α诱导的抗病毒分子PKR和2′-5′OAS表达的影响及其机制。HCV核心蛋白表达质粒转染HepG2细胞,RT-PCR分析PKR和2′-5′OAS的mRNA水平变化,荧光素酶活性分析核心蛋白对ISRE介导的基因表达的影响;Western-blot分析SOCS3、STAT1及STAT1磷酸化水平的变化。在干扰素α刺激情况下,表达HCV核心蛋白的细胞中,PKR和2′-5′OAS的mRNA水平下降,ISRE介导的荧光素酶活性降低,STAT1磷酸化水平下降。此外,核心蛋白表达的细胞中SOCS3的mRNA和蛋白水平明显升高。结果表明,HCV核心蛋白可能通过激活SOCS3、抑制STAT1的磷酸化,从而下调干扰素α诱导的PKR和2′-5′OAS表达。

重叠延伸PCR法构建VPS4B基因定点突变真核表达载体

目的构建含液泡蛋白质分选因子4B(VPS4B)基因定点突变的真核表达载体。方法用RT-PCR法从HuH-7细胞中扩增VPS4B基因,并克隆到真核载体pXF3H上。采用重叠延伸PCR定点突变技术,构建K180Q和E235Q两种突变质粒,经DNA测序确证定点突变的结果,再将VPS4B及两种突变载体转染HepG2细胞,western blot检测融合蛋白表达。结果克隆了VPS4基因,构建了真核载体pXF3H-VPS4B,经重叠延伸PCR得到突变体。DNA测序结果显示,编码180位氨基酸的538～540位碱基由AAG突变为CAG;编码235位氨基酸的703～705位碱基由GAA突变为CAA,其他碱基均无突变。VPS4B及两种突变载体转染HepG2细胞可检出HA-VPS4B融合蛋白表达。结论成功构建了VPS4以及K180Q和E235Q两种突变的真核表达载体。

HBV感染者血清趋化因子IP-10和RANTES的表达及其临床意义探讨

目的探讨HBV感染者血清IP-10和RANTES水平及其临床意义。方法采用ELISA定量检测正常人、自限性HBV感染者、慢性HBV携带者和慢性乙型肝炎患者血清IP-10和RANTES水平。结果与正常人比,自限性HBV感染者、慢性HBV携带者和慢性乙型肝炎患者血清IP-10(P=0.002,P=0.002,P=0.01)和RANTES(P=0.01,P=0.02,P<0.001)表达均明显上调;自限性HBV感染者、慢性HBV携带者和慢性乙型肝炎患者之间血清IP-10水平无显著性差异(P>0.05),但自限性HBV感染者血清RANTES水平较其他两组明显升高(P=0.005,P=0.03);慢性乙型肝炎患者血清IP-10(P=0.001)和RANTES(P=0.02)水平均明显高于慢性HBV携带者;HBeAg阴性和阳性者之间两指标无显著性差异(P=0.08,P=0.42);HBV DNA阳性者血清IP-10(P=0.016)和RANTES(P=0.02)水平均明显高于HBV DNA阴性者。结论IP-10和RANTES的趋化作用广泛参与了机体对HBV免疫应答的各个阶段,并在肝脏组织的炎性损伤中发挥了作用。

HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体的构建及初步检测应用

目的:构建2种HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体,并初步用该2种四聚体检测针对不同抗原肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL)。方法:原核高效表达HLA-A*2402-BSP和β2m蛋白后,分别与乙型肝炎病毒抗原肽Pol756-764和Core117-125在体外复性折叠成可溶性的HLA-A*2402抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体,分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成2种HBV抗原肽四聚体。最后进行流式细胞术检测。结果:Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了2种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物单体。结论:构建的2种四聚体可以检测乙型肝炎感染者体内特异性的CTL。

三种常见HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物四聚体的构建及初步检测应用

目的体外构建三种常见HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物四聚体,并初步用该三种四聚体对抗原肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL)进行了初步检测。方法原核高效表达的HLA-A*0201-BSP和β2m蛋白,分别和三种HBV抗原肽(HBVCore18-27,Env335-343,Pol575-583)体外复性折叠成可溶性的HLA-A*0201抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体,分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成相应的三种抗原肽四聚体。最后进行流式细胞仪检测。结果Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了三种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物单体。构建的三种四聚体均可以检测到相应特异性的CTL,在自限性感染患者体内针对乙肝核心抗原(core18-27)的CTL细胞频数(0.18%)高于针对聚合酶抗原(pol575-583)(0.08%)和包膜抗原(env335-343)(0.06%)。结论成功构建了三种具有完整构象的生物素化HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物单体,所构建的三种四聚体都可以检测到抗原特异性的CTL。

转化生长因子β信号传导途径的失活与胃癌的癌变过程的关系

目的 探讨转化生长因子 β(transforminggrowthfactotβ ,TGF β)信号传导途径的失活与胃癌的癌变过程的关系。方法 12 1例标本包括正常胃粘膜 3 3例 ,肠化生 2 3例 ,不典型增生 2 0例 ,早期胃癌 11例 ,进展期胃癌 3 4例 ,通过免疫组化法检测了它们的TGF β受体 (RⅠ、RⅡ、RⅢ )和Smad4蛋白的表达。结果 TGF βRⅠ、RⅡ、RⅢ表达的阳性率随着胃组织恶性程度的增加而降低 ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。且伴局部淋巴结转移的胃癌中TGF βRⅡ表达的阳性率较低 ,与不伴局部淋巴结转移的相比差异有显著性 (P <0 .0 5 )。仅仅于 4例 (11% )进展期胃癌患者 (均伴局部淋巴结转移 )中观察到了Smad4的缺失表达。结论 TGF β信号传导途径与胃癌的癌变过程密切相关 ,其失活使癌细胞失去了对TGF β的生长抑制反应。我们推测TGF β信号传递途径的失活在两个不同的方面影响着胃癌 ,一个是通过TGF β受体的失活 ,另一个是通过Smad4蛋白的失活。

人IL-10真核表达载体的构建及其在体内外的高效表达

白细胞介素10（interleukin10，IL-10）是一种多效细胞因子，在免疫调控中发挥了重要作用，其在病毒持续性感染中的作用也日益受到关注。有研究显示HBeAg阳性患者血清高水平的IL-10和IL-12与早期自发的HBeAg血清转换相关[1]，也有研究结果显示IL-10与病毒感染的持续与清除相关[2]。IL-10在肝脏疾病中还显示出抗炎和抗纤维化作用[3]。

影响慢性乙型肝炎病毒感染者临床结局的病毒学因素研究进展

慢性乙型肝炎患者临床结局受多种因素的影响,主要包括宿主因素和病毒学因素两大方面,其中病毒学因素包括HBVDNA载量,HBV基因型、HBV基因变异及HBV蛋白表达等。本文就影响慢性乙型肝炎病毒感染者临床结局的病毒学因素研究进展进行了介绍。

乙型肝炎病毒S基因系列单突变克隆人工构建

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)S基因高频突变位点(Tl26S,Ml33L,Tl44A)变异对HBV生物学活性的影响,开发新的检测HBsAg试剂盒,混合HBV多价疫苗及多效价的乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)。方法:利用人工定点突变技术,基因重组,建立系列HBVS基因‘a’决定簇真核细胞表达的质粒。结果:测序和计算机软件分析,克隆的质粒基因突变序列完全正确,并且能在真核细胞中表达,被HBsAg单克隆抗体识别。结论:所构建的乙型肝炎病毒S基因单突变克隆能够在真核细胞表达蛋白,所表达的蛋白可以正确折叠,维持天然二级构象,具有良好的抗原性,为开发新的检测试剂盒,HBV疫苗及高效价的乙型肝炎免疫球蛋白奠定物质基础。