肠艾美耳球虫重组微线蛋白2对家兔免疫保护效果评价

本研究旨在评价肠艾美耳球虫重组微线蛋白2(rEiMIC2)对兔的免疫保护效果,为肠艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研究提供参考。在肠艾美耳球虫转录组数据中筛选出EiMIC2基因,进行克隆、原核表达和蛋白纯化,并采用免疫印迹检测重组蛋白的免疫反应性。将35日龄无球虫新西兰幼兔32只随机分为4组(未免疫未攻虫组、未免疫攻虫组、pET-32a(+)载体组和rEiMIC2免疫组),每组8只,未免疫未攻虫组和未免疫攻虫组每只颈部皮下注射1 mL无菌PBS,pET-32a(+)载体组和rEiMIC2免疫组每只分别接种100μg pET-32a(+)载体蛋白、rEiMIC2,首免后2周进行二免。二免14 d后,除去未免疫未攻虫组,其余3组每只新西兰兔口服接种5×10^(4)个肠艾美耳球虫孢子化卵囊;攻虫14 d后安乐死所有新西兰兔。重组蛋白免疫兔后通过观察临床症状、肠道病变、测定兔的相对增重率、卵囊减少率、抗球虫指数(ACI)值和料肉比以及检测血清中特异性IgG、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ综合评价rEiMIC2的免疫保护效果。结果显示,EiMIC2基因开放阅读框长度为1 605 bp,编码的蛋白分子质量约为57.68 ku。免疫印迹显示rEiMIC2能够被阳性血清所识别,表明其具有良好的免疫反应性。免疫保护试验显示:攻虫后各组幼兔陆续出现精神沉郁和腹泻的症状,未免疫攻虫组和rEiMIC2免疫组各有1只兔死亡;rEiMIC2免疫组相对增重率为73.97%,卵囊减少率为69.98%,ACI值为136.97,料肉比为3.98∶1,与未免疫攻虫组差异显著(P<0.05);rEiMIC2免疫组肠道病变与未免疫攻虫组相比较轻,血清中特异性IgG水平显著高于未免疫攻虫组(P<0.05)。综上,rEiMIC2免疫兔后,能有效减少卵囊排出和增重损失,减轻肠道损伤,具有一定的保护效果。

兔斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫PCR检测靶标的筛选与单一、多重直接PCR检测方法的建立

旨在建立快速、简便的兔斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫直接PCR检测方法。首先克隆斯氏艾美耳球虫线粒体基因组mtDNA和3种兔球虫顶质体基因rpoB,结合GenBank中收录的其它兔球虫的相关序列进行比对分析,然后以种间差异明显的序列为靶基因在其超变区设计多对特异性引物,同时对引物浓度等条件进行优化,并评价PCR方法的敏感性和特异性。本研究首次测定了斯氏艾美耳球虫线粒体基因组全序列和3种兔球虫顶质体基因rpoB的序列,斯氏艾美耳球虫mtDNA全长6277 bp,包括3个蛋白质基因,与其它6种兔球虫mtDNA序列相似率为93.90%~97.45%;斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫顶质体基因rpoB大小在500 bp左右,三者相似性达93.93%~95.30%。靶基因筛选结果表明3种兔球虫ITS与其它基因(rpoB和mtDNA)相比较具有种内保守和种间差异大的特点,更适合用于分子诊断;基于3种兔球虫ITS序列的引物中,Ps1、Pi2、Pm2在单一或多重检测时均具有良好的特异性和敏感性。本试验通过对艾美耳球虫PCR检测候选基因靶标(ITS、mtDNA和rpoB)进行序列分析,筛选ITS为兔球虫种间差异明显的检测靶标基因,在此基础上建立的单一直接PCR方法和多重直接PCR方法具有特异、敏感、操作简便的优点,可用于3种兔球虫的流行病学调查或兔球虫病临床诊断。

斯氏艾美耳球虫泛素结合酶重组蛋白对家兔免疫保护效果的评价

观察斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedai)重组蛋白r Es-UCE、r Es-EFG和r Es-DG32对家兔的免疫保护效果。利用相对荧光定量PCR分析Es-UCE、Es-EFG和Es-DG323个基因在虫体不同发育时期的转录水平并进行原核表达与蛋白纯化。在进行了3个重组蛋白对家兔的免疫保护效果初步试验后,筛选出r Es-UCE进行进一步评价,将42只45日龄无球虫家兔分为空白对照组、攻虫对照组、空载蛋白对照组、佐剂对照组和r Es-UCE免疫组,各组分别颈部皮下注射1 m L无菌PBS,1 m L无菌PBS,1 m L(2 mg/m L)皂素,1 m L(100μg/m L)Trx-His-S tag蛋白,1 m L(100μg/m L)r Es-UCE,14 d后同等剂量进行二免。二免后第14天攻虫,除空白对照组外每只无球虫兔经口感染1×10^(4)个斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊。感染后定期观察各组兔的临床症状、称重并采血,感染后第21天剖检并收集直肠粪样,测定并统计各组兔的死亡率、卵囊排出量、相对增重率、料肉比、肝指数、血清种特异性抗体与细胞因子等。结果显示,试验各组均未出现死亡,r Es-UCE免疫组平均相对增重显著大于攻虫对照组(P<0.05),肝指数显著低于攻虫对照组(P<0.05)。r Es-UCE免疫组相对增重率达90.69%,卵囊减少率达78.81%,细胞因子(IL-2、IL-10、IL-17和IFN-γ)水平和特异性抗体水平均与对照组存在显著差异(P<0.05)。结果表明,r Es-UCE可作为斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。