RNAi抑制肾癌细胞MDR1基因表达及对顺铂化疗耐药的逆转

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)对肾癌细胞多药耐药基因1(multidrug resistance,MDR1)表达的抑制作用,并分析干扰前后肾癌细胞对顺铂(cisplatin)敏感度的变化。方法:根据MDR1基因序列设计3条小干扰RNA(small in-terfering RNA,siRNA),转染肾癌A498细胞;RT-PCR法检测转染前后MDR1 mRNA表达水平的变化,筛选出干扰效率最高的siRNA序列;进而利用慢病毒包装siRNA重组质粒,感染A498细胞,RT-PCR法筛选沉默效果最好的细胞株进行克隆;Western印迹法检测MDR1蛋白表达水平;MTT法检测干扰前后顺铂对半数细胞抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)的变化。结果:3条siRNA序列均能不同程度地抑制细胞MDR1基因的表达,其中siRNA-1序列能更有效地封闭MDR1基因,使MDR1 mRNA表达水平下降67%;筛选得到稳定转染的细胞株与未干扰细胞株相比,MDR1蛋白表达量明显下降(P<0.01),并使顺铂对细胞的IC50值降低约83.37%(P<0.01)。结论:RNAi能有效抑制肾癌A498细胞MDR1基因的表达,并可显著增加其对顺铂的敏感度,从而使肾癌细胞化疗耐药逆转成为可能。

认知策略在实验诊断学教学中的体现

根据实验诊断学培养临床应用能力的教学目标,将认知策略中的注意策略、编码策略、提取策略、解决策略融于教学方法中,将分类法、化归法、推理法等体现在教学思维中,以培养学生形成科学的临床思维方式.

皮质醇对牛蛙心肌收缩的快速作用

本实验采用八木氏法灌流牛蛙心脏，经换能器、放大器输入计算机记录心肌的收缩活动，观察皮质醇对牛蛙心肌收缩的作用。结果如下：①灌流１×１０－６ｍｏｌ／Ｌ皮质醇，蛙心收缩幅度增大，潜伏期平均为１８．７ｓ，蛙心收缩频率无明显改变（ｎ＝６０）。②灌流２×１０－７ｍｏｌ／Ｌ～１×１０－６ｍｏｌ／Ｌ不同浓度皮质醇后，随着皮质醇浓度的增加，心肌收缩幅度也增大，表现明显的量效关系（ｎ＝２０）。③甾体激素胞内受体阻断剂—１×１０－６ｍｏｌ／ＬＲＵ３８４８６不能阻断皮质醇的作用（ｎ＝２０）。④经蛋白合成抑制剂—放线菌酮作用２０ｍｉｎ后，再灌流１×１０－６ｍｏｌ／Ｌ皮质醇，心肌收缩幅度仍增大（ｎ＝２０）。上述结果提示：皮质醇对牛蛙心肌收缩具有快速增强作用。

不同年龄条件下泛素羧基端水解酶-L1基因多态与帕金森病发病的相关性研究

目的探讨不同年龄条件下泛素羧基端水解酶-L1基因(UCH-L1)第3外显子丝氨酸/酪氨酸(C/A)多态、第4外显子丝氨酸/苯丙氨酸(C/T)多态与帕金森病发病风险间的关系。方法采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP),在164例帕金森病患者和172例健康对照中观察UCH-L1基因C/A和C/T多态的分布,并通过比数比(OR)进行相关分析。结果帕金森病组中UCH-L1第3外显子的C等位基因频率(62.2%)明显高于对照组(51.7%)(OR=1.534,P=0.006),CC基因型频率(36.6%)亦明显高于对照组(23.3%)(OR=1.904,P=0.008),而且这种正相关主要存在于≥60岁的帕金森病患者中(OR=2.689,P=0.002)。帕金森病组中UCH-L1第4外显子C/T多态等位基因和基因型频率的分布与对照组比较无显著差异,进行年龄分层后该基因多态在两组人群中的分布差异仍无统计学意义。结论UCH-L1第3外显子C等位基因可能是老年人帕金森病发病的危险因子,而第4外显子C/T多态则与帕金森病发病无关。

RNAi逆转肾癌细胞MDR1基因表达导致的替尼泊苷耐药

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)对肾癌细胞多药耐药基因(MDRl)表达的抑制作用,并分析干扰前后肾癌细胞对替尼泊苷(VM-26)敏感性的变化。方法:根据MDRl基因设计3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列,在质粒的介导下转染肾癌A498细胞,RT-PCR法分析转染前后MDR1mRNA表达水平,筛选出干扰效率最高的siRNA序列;进而利用慢病毒包装siRNA重组质粒,感染A498细胞,RT-PCR法筛选沉默效果最好的细胞株进行克隆,Western bolt法检测MDR1蛋白表达水平,MTT法对比干扰前后替尼泊苷对细胞半抑制浓度(IC50)的变化。结果:3条siRNA序列均能不同程度地抑制细胞MDR1基因的表达,其中siRNA-1序列能更有效地封闭MDRl基因,使MDRl mRNA表达水平下降67%;筛选出的稳转细胞株与未干扰细胞株相比,MDR1蛋白表达量明显下降,并使替尼泊苷对细胞的IC50降低约79.8%,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:RNAi可抑制肾癌A498细胞MDRl基因的表达从而逆转其对替尼泊苷的耐药,使肾癌细胞化疗耐药逆转成为可能。

替莫唑胺联合生物疗法预防晚期黑色素瘤脑转移临床分析

目的评价接受替莫唑胺+铂类+生物治疗及传统药物达卡巴嗪+铂类+生物治疗不同方案治疗晚期黑色素瘤1年中脑转移情况;探讨O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)表达与替莫唑胺疗效的关系。方法88例晚期黑色素瘤患者中52例接受替莫唑胺+顺铂化疗6周期,36例患者接受达卡巴嗪+顺铂化疗6周期,观察治疗1年后两组脑转移发生率及MGMT表达与替莫唑胺疗效的关系。结果替莫唑胺组治疗1年后仅有2名患者发生脑转移,发生率为3.85%;达卡巴嗪组6名患者发生脑转移,发生率为16.67%。MGMT(-)组疾病控制率为80%,MGMT(+～++)组40.91%。结论替莫唑胺治疗组脑转移率明显下降。MGMT表达与替莫唑胺药效有关,MGMT表达阴性治疗有效率更高。治疗前检测MGMT的表达情况,可预测化疗敏感性,制定个体化治疗方案,克服耐药,提高治疗效果。

上海地区帕金森病基因与4种多巴胺递质代谢相关基因(英文)

目的:探讨4种多巴胺递质相关基因COMT,DBH,DAT1和MAOB的多态性与上海地区居民帕金森氏病的易感性的关系。方法:用聚合酶链式反应和限制性片段长度多态性(PCR/RFLP)技术检测4种多巴胺能递质代谢相关基因多态性,对144名原发性帕金森病病人和年龄相匹配的188名健康人进行相关性分析。结果:与健康人相比,帕金森病患者DBH基因型或等位基因的分布不同,两组之间的差异有统计学意义。结论:DBH多态性在中国汉族人帕金森氏病的易感性中可能起作用。

NDRG4基因甲基化检测在结直肠癌早期诊断中的应用研究

目的探讨NDRG4甲基化检测在结直肠癌诊断中的价值。方法从84例结直肠癌手术切除癌组织、癌旁组织及其术前粪便、尿、血中提取DNA,应用巢式甲基化特异性PCR(nested methylation specific PCR,nMSP)检测结直肠癌粪便、尿、血中NDRG4基因甲基化水平。比较结直肠癌组织和粪便、尿、血中NDRG4甲基化检测在结直肠癌诊断中的敏感性和特异性。结果在84例结直肠癌中,癌组织NDRG4检出率为81.0%,癌旁组织检出率为8.3%,敏感性为81.0%,特异性为91.7%;结直肠癌中粪便NDRG4基因甲基化的敏感性和特异性在3个微量DNA中最高,尿次之。结论结直肠癌组织NDRG4基因甲基化异常发生率高;粪便和尿中NDRG4甲基化异常可作为结直肠癌早期诊断的肿瘤标志物。

球囊后凸椎体成形术对椎体转移癌患者疼痛缓解和功能恢复的作用

目的:观察经皮球囊后凸椎体成形术(PKP)在缓解椎体转移癌患者疼痛和功能恢复中的临床价值。方法:28例椎体转移癌患者接受了PKP治疗。记录并比较患者手术前后止痛药物应用比例、疼痛程度、止痛药用量和活动能力。结果:45个椎体的PKP手术均1次成功。术后1周13例(46.4%)患者疼痛完全缓解,13例(46.4%)明显缓解。术后止痛药物应用比例、疼痛评分、活动能力评分较术前明显改善(P<0.01)。结论:PKP能快速缓解椎体转移瘤引起的疼痛,增强病椎强度和稳定性,预防病椎进一步压缩骨折,具有简单、安全、有效等优点。

血清6-磷酸葡萄糖异构酶水平对类风湿关节炎的诊断价值

目的:探讨类风湿关节炎(RA)患者血清6-磷酸葡萄糖异构酶(GPI)含量与其他体液免疫指示之间的相关性及对RA的诊断价值。方法:用ELISA法检测60例RA患者、55例SLE患者、20例其他自身免疫病患者及130例非自身免疫病对照组的血清GPI浓度。用全自动特种蛋白仪检测60例RA患者的体液免疫指标。结果:当GPI以0.33μg/ml为临界时,60例RA患者GPI阳性率为38%,55例SLE患者为29%,20例其他自身免疫病患者为25%,70名正常对照阳性率为4.2%,20例炎症患者为10%,20例肿瘤患者及20例乙型肝炎患者阳性率均为零。当临界值为2.0μg/ml时,60例RA患者GPI阳性率为25%,此时其敏感度为25%,特异度为98.2%;55例SLE患者阳性率为5.5%;20例其他自身免疫病患者、70名正常对照、20例炎症、20例肿瘤患者及20例乙型肝炎患者GPI值均为零。RA患者中GPI浓度与类风湿因子(RF)浓度呈正相关(r=0.828,P<0.05),但与其他体液免疫指标无相关性。结论:GPI对RA的发生可能起到一定的作用。尤其当值>2.0μg/ml时,对RA的诊断具有较高的特异性。

CREB_1蛋白在大鼠急、慢性吗啡依赖和戒断中的表达变化

目的研究急、慢性吗啡依赖和戒断对大鼠脑组织cAMP反应元件结合蛋白(CREB1)的表达调节作用。方法雄性SD大鼠36只,随机分为急性对照组、急性吗啡依赖组、急性吗啡戒断组、慢性对照组、慢性吗啡依赖组、慢性吗啡戒断组,每组6只。采用免疫组化方法测定不同脑区和核团CREB1蛋白表达水平。结果急性吗啡依赖和戒断抑制蓝斑CREB1蛋白表达。慢性吗啡依赖和戒断增加皮质、海马、蓝斑等脑区核团CREB1蛋白的表达,但是在慢性吗啡依赖和戒断时,伏隔核CREB1蛋白表达下降。结论急、慢性吗啡依赖和戒断时CREB1在大鼠皮质、海马、下丘脑、蓝斑、伏隔核等脑区的表达存在差异,可能与介导阿片类药物依赖信号转道通路的反应性不同有关。

MDA-MSP技术检测粪便miR34b/c甲基化及其在结直肠癌早期诊断中的意义

目的:探讨粪便miR34b/c甲基化状态的检测在结直肠癌早期诊断中的意义.方法:从126例结直肠癌患者癌组织、癌旁组织、粪便和64例正常对照者的粪便中分别提取DNA,采用多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)技术对经过亚硫酸氢盐修饰样本进行全基因组扩增,结合甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测组织和粪便中miR34b/c基因甲基化状态.结果:结直肠癌癌组织miR34b/c基因的甲基化阳性率为95.2%(120/126),对应的癌旁正常组织为11.9%(15/126),两者比较有显著差异(P<0.01);miR34b/c甲基化状态与各临床病理参数无显著相关(P>0.05).结直肠癌粪便miR34b/c甲基化阳性率为90.2%(111/123),显著高于正常对照7.8%(5/64),差异有统计学意义(P<0.01).粪便DNAmiR34b/c用于结直肠癌早期诊断的敏感性为91.2%,特异性为92.2%.结论:miR34b/c甲基化是结直肠癌的重要分子特征,检测粪便miR34b/c甲基化有望成为结直肠癌早期诊断的一个全新的肿瘤标志物.MDA结合MSP为miRNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段.

氟脲嘧啶诱导Egr-1启动子转录调控Flt3配基的基因表达

目的:探讨5-氟脲嘧啶(5-Fu)诱导Egr-1启动子调控造血生长因子基因表达对化疗后造血损伤的恢复作用。方法:构建携带Egr-1调控序列启动的Flt3配基(FL)和EGFP双顺反子基因pCIneo真核表达载体(Egr-EF);通过脂质体转染骨髓基质细胞系HFCL并称为HFCL/EF;采用流式细胞术和倒置荧光显微镜观察EGFP绿色荧光表达的阳性细胞;采用RT-PCR、Western blot和ELISA检测5-Fu对HFCL/EF细胞FL表达的影响;流式细胞术检测经5-Fu处理的HFCL/EF细胞上清对CD34+细胞和CFU-GM的增殖作用;采用活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸鉴定化疗通过活性氧诱导Egr-1启动子CArG序列调控下游基因表达的特异性。结果:构建了Egr-1调控序列启动的双顺反子基因表达载体(Egr-EF);经5-Fu处理后HFCL/EF细胞培养上清液较未加5-Fu组的FL含量明显增高并且对CD34+细胞和CFU-GM具有较强的扩增作用(P<0.01);在5-Fu处理的HFCL/EF细胞中,EGFP活性、FLmR-NA和FL蛋白表达增强,而且,N-乙酰半胱氨酸明显减少FL含量。结论:5-Fu诱导Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达对化疗药物处理后的造血损伤具有一定的恢复作用。

阿霉素诱导Egr-1启动子调控的造血因子GM-CSF基因表达对荷瘤小鼠造血功能恢复的影响

本研究探讨阿霉素(ADM)诱导早期生长因子(Egr-1)启动子调控的造血因子基因表达对荷瘤小鼠化疗后造血功能恢复的作用。将构建的携带有Egr-1启动子的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)cDNA和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)cDNA双顺反子真核表达载体导入基质细胞HFCL后,输入重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内。实验小鼠随机分4组:①ADM诱导的HFCL/EG组(HFCL/EG+ADM组),②ADM诱导的HFCL组(HFCL+ADM组),③单纯输注HFCL/EG组(HFCL/EG组)和④单纯输注HFCL组(HFCL组),每组6只动物。观察外周血象动态改变,用流式细胞术检测eGFP+人基质细胞,用RT-PCR和Western blot分别检测GM-CSFmRNA及其蛋白的表达。结果表明:化疗组与未化疗组相比外周血白细胞降低,而且下降幅度较低,恢复加快;各组间CFU-GM数无显著性差异;肿瘤抑制率与化疗相关,而与外源基因表达不相关;ADM处理后实验组小鼠骨髓可见绿色荧光阳性的基质细胞;RT-PCR和Western blot显示GM-CSF mRNA和GM-CSF蛋白表达增强。结论:ADM诱导的Egr-1启动子造血因子基因疗法具有化疗后促进造血恢复作用。

转录水平RNA干扰肝素酶基因对肝癌细胞侵袭能力的影响

目的探讨转录水平基因沉默(TGS)技术和转录后水平基因沉默(PTGS)技术对肝素酶(HPA)基因干扰效果及其对肝癌SMCC-7721细胞侵袭能力的影响。方法从HPA基因启动子区和编码区分别设计并合成TGS和PTGS的小干扰RNA(siRNA),并转染肝癌细胞SMMC-7721;实时半定量PCR和Western blotting检测TGS和PTGS siRNA转染后48、72和96h HPA的表达,并设空白组作为对照;Transwell小室实验检测干扰后SMMC-7721细胞的侵袭能力。结果 TGS和PTGS两种技术在转染48h后,从mRNA和蛋白水平上均能成功干扰HPA表达;转染后72h,PTGS组HPA恢复表达,而TGS组仍保持沉默;转染后96h,两组HPA均恢复表达。Transwell小室实验表明,TGS和PTGS组HPA基因均能使SMCC-7721的穿膜细胞数减少,TGS组效果更明显。结论 TGS技术沉默肝癌SMMC-7721细胞中HPA基因的能力优于PTGS技术,并使肝癌细胞的侵袭能力显著降低。

肝细胞癌组织中HLA-DR,-DQ的表达及其意义

目的探讨人白细胞抗原(HLA)-DR和-DQ分子在肝细胞癌的表达及其意义。方法采用免疫组化法分别检测HLA-DR和HLA-DQ抗原在38例人肝癌组织芯片中的表达情况,并和临床病理资料进行相关性分析。结果肝癌组织中HLA-DR和HLA-DQ抗原信号主要定位于细胞浆。HLA-DR的阳性率为5.3%(2/38),HLA-DQ的阳性率为92.1%(35/38),但在4例伴淋巴结转移的肝癌中,3例无HLA-DQ的表达,HLA-DQ表达与肝癌的淋巴结转移负相关(P<0.0001)。HLA-DR和HLA-DQ表达与年龄和肝癌的组织分化无相关性(P>0.05)。结论 HLA-DQ的表达在肝癌组织中很常见,无HLA-DQ的表达可能提示与淋巴结转移有关。

高等医学院校实验诊断学教师队伍现状分析

分析医学院校实验诊断学教师队伍现状,归纳大致存在四种类型:出色型、胜任型、应付性及不胜任型;提出改进措施,提倡实验诊断学教学要由热爱教学、善于教学、胜任教学的人员承担.