Ⅰ群禽腺病毒血清11型的分离鉴定及致病性试验

【目的】了解江苏地区禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)的基因遗传演化情况及致病性,为FAdV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】通过SPF鸡胚盲传、PCR鉴定、电镜观察、全基因组测序、序列比对与相似性分析判定病毒血清分型,并将分离株以5×105.33 EID50剂量胸肌注射的方式感染10日龄SPF雏鸡进行动物回归试验。【结果】PCR结果显示,该分离株为Ⅰ群FAdV阳性,在透射电镜下可见球型、无囊膜、具有腺病毒典型的二十面体结构,通过全基因组和Hexon基因进行序列分析表明该分离毒株为FAdV D种血清11型毒株,命名为JSNT-1株。将该毒株感染SPF雏鸡,死亡率为10%(1/10),病死鸡剖检可见肝脏褪色变黄,出血肿胀,边缘钝圆;肾脏肿大出血,苍白等病变。通过实时荧光定量PCR试验可从口腔及泄殖腔中检测到排毒,且病毒在鸡体内多个组织器官均有分布。病理组织学结果显示,死亡鸡的肝细胞变性坏死,出现嗜碱性核内包涵体;肾小球上皮细胞变性坏死;心肌可见大量炎性细胞浸润。【结论】分离株为FAdV血清11型,感染SPF鸡后临床发病不明显,致死率低,病死鸡能产生特征性的包涵体肝炎病变,且病毒可在鸡体内外进行复制。

非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及单克隆抗体制备

【目的】表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p72蛋白,并制备其单克隆抗体。【方法】构建原核表达载体pET-28b-p72,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行诱导表达和蛋白纯化;用纯化后的p72蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合并制备单克隆抗体,通过间接ELISA法和亚克隆筛选出分泌抗体的阳性杂交瘤细胞;通过小鼠抗体类型检测试剂盒检测抗体类型;通过体内诱生法制备抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体腹水,使用饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,通过间接ELISA法、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting检测单克隆抗体效价和特异性。【结果】ASFV p72重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,将纯化的p72蛋白制备单克隆抗体,获得4株分泌IgG1抗体的单克隆细胞株,分别命名为6F8、7C3、8H7和9G2。间接ELISA结果显示,6F8与8H7细胞株分泌的抗体效价均为1∶6400,7C3与9G2细胞株的抗体效价均为1∶12800,且4株细胞株分泌的抗体与p72蛋白反应结果均呈阳性,与猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)反应均呈阴性。4株单克隆细胞株分泌的抗体均能与p72真核蛋白发生特异性反应。【结论】本研究成功制备了4株能稳定分泌与ASFV p72蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究ASFV p72蛋白的功能以及非洲猪瘟的防控和诊断建立了基础。

H5亚型禽流感病毒HA蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达与纯化

为表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白研制亚单位疫苗,构建了pFastBAC-HA重组质粒,转化至DH10Bac感受态细胞,获得重组HA基因的杆状病毒质粒,再将重组杆状病毒质粒转染至Sf9细胞,拯救重组病毒,通过间接免疫荧光和Western blot试验对Sf9细胞中表达的HA蛋白进行鉴定。结果表明表达的重组HA蛋白均能与抗Strep标签抗体、H5亚型禽流感病毒阳性血清(Re-11株)特异性结合,且HA重组蛋白在昆虫细胞中以细胞分泌上清的形式表达,红细胞凝集效价为1∶64,利用链霉素亲和层析的方法,纯化重组HA蛋白,纯化后HA蛋白浓度为0.364 mg/mL。试验结果可为禽流感病毒亚单位疫苗研制、HA蛋白单克隆抗体制备提供前期基础。

非洲猪瘟病毒B602L蛋白的真核表达及多克隆抗体的制备

为表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白,制备相应的多克隆抗体,根据NCBI网站上公布的非洲猪瘟病毒(Pig/HLJ/2018株)B602L基因序列进行密码子优化和基因合成,随后克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1中,获得重组杆状病毒质粒,再把重组杆粒转染昆虫细胞Sf9,拯救重组B602L基因的杆状病毒。经间接免疫荧光和western blots鉴定结果显示,B602L重组蛋白与His标签抗体、非洲猪瘟标准阳性血清均能发生特异性反应,并且B602L重组蛋白可以细胞分泌上清的形式进行表达。通过His镍株亲和纯化的方式纯化重组蛋白,B602L蛋白大小约70 ku,与预期相符。将B602L重组蛋白与弗氏佐剂配比免疫BALB/c小鼠,制备小鼠多克隆抗体,经间接ELISA检测,该抗体效价可达1∶512000,并且与B602L重组蛋白具有良好的反应性。本研究可为进一步研究非洲猪瘟B602L蛋白的结构与功能、研制非洲猪瘟诊断制品提供生物材料。

H7亚型禽流感病毒HA蛋白在Sf9中的表达与纯化

【目的】真核表达H7亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA蛋白,为进一步制备H7亚型HIV亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞(Spodoptera frugiperda clone 9,Sf9)的密码子偏嗜性,优化并合成H7亚型AIV的HA序列,将其克隆至穿梭质粒pFastBac1中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至Sf9中,通过间接免疫荧光和Westernblots试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过SYBRgreen染料法荧光定量PCR试验,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR定量方法,筛选出在Sf9中表达HA重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白。【结果】表达H7亚型AIV HA蛋白的重组杆状病毒在Sf9盲传3代后,Sf9开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和Western blots试验发现,Sf9内出现可与HA重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的HA重组蛋白条带大小约70 kD左右,与预期相符,且HA重组蛋白可与H7亚型AIV阳性血清反应,表明HA重组蛋白表达成功;以构建的pUC19-gp64质粒为标准,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR检测方法,该方法在1×103~1×108 copy/μL间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数R2=0.993;利用qPCR检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过Western blots试验筛选HA蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以10MOI的比例接种Sf9,孵育72h,蛋白表达效果最好;通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白,蛋白浓度为0.268mg/mL,鸡红细胞凝集效价为4log2。【结论】本试验在Sf9中成功表达并纯化H7亚型AIVHA蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量PCR检测方法,可为进一步评价H7亚单位疫苗的免疫原性提供参考。