猪萨佩罗病毒HNHB-01株VP1基因的表达与分子特征

猪萨佩罗病毒(PSV)VP1蛋白是位于病毒粒子表面的结构蛋白,发挥主要的抗原效应。为了弄清PSV HNHB-01株VP1基因的表达与分子特征,本研究设计针对VP1基因的特异性引物,通过RT-PCR扩增获得VP1基因,并重组到真核表达载体pCAGGS上,经Western blot、间接免疫荧光鉴定,成功表达VP1蛋白。随后基于PSV HNHB-01株全基因序列以及VP1基因序列与其他参考毒株的基因序列构建遗传进化树,分析遗传进化关系。结果表明:实验室分离的HNHB-01株与2017年分离的HNXX-01株亲缘关系最近,与日本株JPSV-1315关系接近;HNHB-01 VP1基因与国内2016-2017年流行的毒株HNXX-01、PSV-A2、JXXY-a2的VP1基因高度同源,与国外2009年流行的日本毒株JPSV1315的VP1基因亲缘关系较近;HNHB-01株VP1氨基酸与HNXX-01株VP1氨基酸同源性最高,同源性为99.32%。三级结构分析表明,VP1蛋白存在3条位于蛋白结构外侧的抗原表位区,对应的氨基酸序列分别为20~30 aa、90~100 aa和265~275 aa。本研究为PSV感染的诊断与预防提供依据,并为今后研究VP1基因的功能和开发疫苗奠定基础。

猪δ冠状病毒感染猪树突状细胞及对免疫因子分泌能力的影响

以猪树突状细胞(porcine dendritic cells,pDCs)为模型,探究猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是否能够对pDCs进行有效感染及对抗病毒细胞因子分泌的影响。采集猪外周抗凝血,分离获得猪外周血单核细胞,经白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)诱导培养获得未成熟树突状细胞,利用倒置显微镜和透射电镜观察其生物学形态,通过蛋白质免疫印迹和激光共聚焦试验检测病毒是否可以对pDCs进行感染,qRT-PCR检测抗病毒因子IFN-α和ISG56的表达。结果显示,成功分离培养得到具有典型树突状细胞形态的pDCs,将PDCoV接种至分离培养得到的pDCs中,PDCoV可以有效感染,可以在pDCs中进行复制并产生感染性的子代病毒颗粒,病毒滴度达到4.4 lgTCID50/0.1 mL。同时检测PDCoV感染pDCs时对抗病毒因子表达的影响,结果表明,在病毒感染pDCs后48 h产生了高水平的IFN-α和ISG56。本研究成功诱导培养得到pDCs,首次证实PDCoV可以在体外感染pDCs,并在细胞中进行有效地复制,pDCs在病毒感染后促进IFN-α、ISG56的分泌来发挥抗病毒免疫效应,为后续研究PDCoV的致病机制提供了新的思路。

猪星状病毒5型衣壳蛋白抗原优势区域的原核表达及其多克隆抗体的制备与应用

猪星状病毒(porcine astrovirus,PAstV)属于星状病毒科,是哺乳动物星状病毒属家族成员,临床上主要引起仔猪呕吐、腹泻等症状,且常与其他病原混合感染。PAstV衣壳蛋白(capsid protein,Cap)与宿主细胞受体结合,诱导机体产生中和抗体,是开发PAstV疫苗的靶蛋白。为制备抗猪星状病毒5型衣壳蛋白的兔源多克隆抗体,本研究通过DNA Star软件对PAstV5 Cap进行抗原性分析,选择出抗原优势区域ORF2开放阅读框1~642 bp(642 bp),构建原核表达质粒pET32a-Cap-642,测序结果正确后将其转化至大肠杆菌Rosetta。经IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为43 ku。重组蛋白经尿素透析法纯化,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。间接ELISA方法测定多克隆抗体效价为1∶51 200,间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western-blot)结果显示抗PAstV5 Cap多克隆抗体能够特异性地识别PAstV5感染猪肾近曲小管上皮细胞(LLC-PK1)中表达的天然抗原;同时将抗PAstV5 Cap多克隆抗体进行了初步应用,结果表明该多抗具有良好反应性。本研究为PAstV5检测方法的建立以及PAstV5衣壳蛋白功能的研究奠定了基础。