敌草快诱导的氧化应激对肉鸡生产性能、肝脏功能、免疫功能和抗氧化性能的影响

为了探讨不同浓度敌草快(Diquat)诱导的氧化应激对肉鸡生产性能、肝脏功能、免疫功能和抗氧化性能的影响,同时确定敌草快诱导氧化应激的最佳剂量和作用时间。本试验将64只16日龄健康AA肉鸡随机分为4个组:对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组,3个试验组分别腹腔注射10、15和20 mg/(kg·bw)敌草快溶液,对照组注射等剂量的无菌生理盐水,试验期21 d。结果显示,3个试验组肉鸡在试验期内均处于氧化应激状态,其中试验Ⅲ组肉鸡有死亡现象,试验Ⅱ组肉鸡采食量和体重下降,肝脏肿大,肝脏功能受损;试验第7天,与对照组相比,试验Ⅱ组肉鸡血清谷丙转氨酶(ALT)活性显著升高(P<0.05),肠黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和血清免疫球蛋白G(IgG)含量显著降低(P<0.05),肝脏组织超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低(P<0.05),血清总抗氧化能力(T-AOC)含量和SOD活性均显著降低(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著升高(P<0.05);试验第21天,各项指标显示氧化损伤有所恢复。结果表明,可选取15 mg/(kg·bw)敌草快作为诱导肉鸡氧化应激的最佳剂量,而且氧化应激效应可持续至21 d,导致肉鸡生产性能下降、肝脏功能受损、免疫功能降低和抗氧化性能降低。

重组低出血抗凝蛋白在毕赤酵母中的中试发酵工艺研究及其纯化与鉴定

目的：通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进，建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白（EH）的中试发酵工艺，为EH蛋白的放大生产研究奠定基础。方法：首先通过摇瓶培养绘测毕赤酵母工程菌的生长曲线，然后根据生长曲线，将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后，直接接种到500L的发酵罐中放大培养，通过发酵液的D_600nm值、溶氧值（D02）及菌体湿重动态监测细菌的生长状态，并用流加甲醇的方法诱导表达目的蛋白；表达上清经超滤、两步离子交换层析纯化获得目的蛋白；用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测目的蛋白的纯度；用SDS-PAGE和质谱方法分析目的蛋白的相对分子质量；用Western印迹验证目的蛋白；用凝块法检测目的蛋白的抗凝活性。结果：发酵结束时，上清中蛋白含量达1．41g／L，经后期分离纯化，得到约21gEH蛋白，SDS-PAGE分析可见EH蛋白在还原状态下表观相对分子质量约为13．2×10^3±0．2×10^3，质谱分析相对分子质量约为7.3×10^3±0．73×10^3；Western印迹表明检测条带为目的蛋白，能被抗水蛭素抗体特异性结合；非还原型SDS-PAGE和HPLC测得EH蛋白的纯度均高于95％；凝块法检测EH蛋白的抗凝比活性为512～1024ATU／mg。结论：建立了一条简便可行的EH蛋白的中试放大发酵生产工艺。

1株鸡源肠炎沙门氏菌的分离鉴定及致病性分析

【目的】确定云南某蛋鸡场送检的疑似沙门氏菌病病料中的主要病原菌种类,并测定其致病性及药物敏感性。【方法】通过细菌分离培养、形态观察、生化试验、血清学鉴定及分子学方法进行细菌分离鉴定;通过对鸡的致病性试验及毒力基因检测分析分离菌的致病性;通过药物敏感性试验检测分离菌耐药情况。【结果】分离菌株在沙门氏菌显色培养基上形成紫色菌落,镜检为革兰氏阴性短杆菌,疑为沙门氏菌,命名为S2;生化试验结果显示,菌株S2赖氨酸脱羧酶、硫化氢、卫矛醇试验结果均为阳性;靛基质、尿素酶、氰化钾、山梨醇、水杨苷、β-半乳糖苷、丙二酸盐生化试验结果均为阴性,判断菌株S2为典型沙门氏菌属;血清学鉴定结果显示,菌株S2属于D群肠炎沙门氏菌,其抗原式为1,9,12:g,m;遗传进化分析结果显示,菌株S2与肠炎沙门氏菌MT621365处于同一分支,自展值为99%;致病性试验结果表明,分离菌株对雏鸡有较强的致病性,感染6 d后雏鸡全部死亡(10/10);毒力基因检测结果显示,菌株S2携带invJ、hilA、ssaB、misL、mgtC、orf319、sopB、spvA、spvB、spvC、spvR、stn和fimA毒力基因,不携带sopA、fliC毒力基因;菌株S2对多数抗菌药敏感程度很高,对阿莫西林-克拉维酸、头孢西丁、四环素等12种抗菌药均敏感,对甲氧嘧啶、复方新诺明和林可霉素耐药。【结论】本研究分离到了1株肠炎沙门氏菌,其毒力较强,可造成雏鸡较高的死亡率,对大部分常用抗菌药敏感,对甲氧嘧啶、复方新诺明和林可霉素具有耐药性。本研究结果可为沙门氏菌病的临床诊断和药物有效性评价提供一定参考依据。

天蚕素抗菌肽在饲料应用中的安全性研究

试验通过考察天蚕素抗菌肽急性毒性和亚慢性毒性评价其安全性,为抗菌肽作为饲料添加剂在畜牧行业的应用提供理论依据。急性毒性试验采用昆明种小鼠进行半数致死量(LD50)和最大给药量(MTD)的测定。亚慢性毒性试验选取昆明小鼠50只,分为5组,分别为空白对照组和4个试验组,通过饲喂给药,试验组添加剂量分别为40、400、4000、2万单位/g,连续饲喂4个月,观察饲喂抗菌肽对小鼠的临床表现,进行日增重、日采食量、料肉比、脏器指数、血液常规、血液生化指标检测。急性毒性试验结果显示,在试验期内未发现小鼠死亡,未测得LD50,小鼠最大给药量为1.28万单位/g,灌胃1 mL时未见毒性。亚慢性毒性结果显示,各给药组小鼠的日增重、脏器指数、血液常规、血液生化与对照组均无显著差异(P>0.05),未见与抗菌肽作用有关的病理变化。另外结果显示,日粮中添加天蚕素抗菌肽可提高小鼠的生产性能,降低小鼠日采食量和料肉比,对动物机体生长起到了积极作用,可安全应用于畜牧行业。

一株高抗氧化活性戊糖片球菌的筛选

【目的】筛选具有高抗氧化性的乳酸菌并进行菌种鉴定,为缓解畜禽养殖过程中的氧化应激提供新型抗氧化微生态制剂。【方法】以体外耐受过氧化氢氧化胁迫方法进行初筛,以体外对过氧化氢的耐受存活率为指标进行复筛,从27株菌株中筛选具有显著抗氧化能力的乳酸菌;然后以DPPH自由基(DPPH·)和羟自由基(HO·)清除能力、还原活性、抗脂质过氧化能力、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)等为指标评价乳酸菌的体外抗氧化性能。【结果】从27株筛选菌株中最终确定了1株具有高抗氧化活性的乳酸菌C2-0327,其对DPPH·清除率为95.2%,HO·清除率达141.0%,还原活性达3147μmol/L(以L-半胱氨酸当量计),抗脂质过氧化率达82.9%,T-SOD活性和T-AOC分别达81.32和20.10 U/mL。经16S rDNA分子鉴定,该菌株为戊糖片球菌C2-0327。【结论】筛选、鉴定得到1株高抗氧化活性乳酸菌,鉴定为戊糖片球菌C2-0327,可用于新型抗氧化微生态制剂的研制。

1株禽大肠杆菌噬菌体的分离及杀菌效果评估

【目的】探索噬菌体作为控制养殖环境致病性大肠杆菌的新手段。【方法】本研究进行了大肠杆菌噬菌体的分离及相应指标评估。通过双层平板法从养殖环境中分离禽致病性大肠杆菌裂解性噬菌体。通过电镜及酶切鉴定、温度及酸碱稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线及其在模拟环境中的杀菌效果对该噬菌体进行综合性评估。【结果】分离得到的噬菌体具有正多面体的头部和细而长的尾部结构,头部直径约98 nm,尾部长约123 nm,结合酶切鉴定结果初步判定该噬菌体为肌尾科双链DNA噬菌体。该噬菌体的温度耐受范围为37~50℃;酸碱耐受范围为pH 3.0~11.0。当感染复数为0.00001时产生的子代噬菌体滴度最高;一步生长曲线测定结果显示,该噬菌体潜伏期为20~40 min,裂解时间为80~100 min,裂解量为4133 PFU/cell。从该噬菌体对模拟环境中宿主大肠杆菌的杀菌效果可看出,浓度为1×10^(4)~1×10^(6) PFU/mL的噬菌体ФECP2-1对液体中目标大肠杆菌作用1~6 h,杀菌率均在99.9%以上;浓度为2×10^(4)~2×10^(6) PFU/g的噬菌体ФECP2-1对鸡粪中目标大肠杆菌作用5~10 h,杀菌率均在99%以上,该噬菌体对鸡粪中目标大肠杆菌杀菌效果略低于对液体中目标大肠杆菌的杀菌效果。【结论】ФECP2-1符合噬菌体类消毒剂相关特征,是一株具有良好应用前景的噬菌体,可作为一种生物消毒剂应用于养殖环境中禽大肠杆菌的防控。

利用基因敲除技术缺失毕赤酵母羧肽酶Y基因的初步研究

目的通过基因敲除技术缺失毕赤酵母编码的羧肽酶Y(carboxypeptidase Y,CPY)基因cpy,观察其对毕赤酵母生长和外源蛋白表达的影响。方法通过PCR方法扩增出内部含有潮霉素B抗性基因的cpy同源序列;通过电转法将同源序列转入GS115-EH感受态细胞中,并用潮霉素B筛选出阳性克隆。用平板显色法测定阳性克隆菌的羧肽酶活性,同时用PCR法鉴定阳性克隆菌的cpy基因是否缺失。对cpy基因缺失的GS115-EH△cpy菌,分别用YPD和BMGY-BMMY培养研究其生长特性;用BMMY培养基进行甲醇诱导表达外源蛋白,观察其蛋白表达的特性。结果 GS115-EH△cpy的羧肽酶基因cpy被成功敲除,羧肽酶活性丧失。YPD培养条件下,GS115-EH△cpy生长后期的D600明显低于GS115-EH,而用BMMY诱导培养基,GS115-EH△cpy的生长明显改善,但仍然低于对照菌。蛋白电泳结果显示甲醇诱导GS115-EH△cpy的蛋白表达量也低于对照菌。结论 GS115-EH△cpy的cpy基因被成功敲除,在YPD培养条件下,其生长低于对照菌,在BMMY培养条件下,其生长明显改善,但仍然较对照菌差,而且其外源蛋白的表达也低于对照菌。