牛CART基因核心启动子鉴定及转录调控分析

旨在筛选牛CART基因核心启动子区并鉴定调控CART表达的转录因子,探究其转录调控机制。本研究采集3头健康母牛下丘脑组织,提取基因组DNA,通过PCR扩增、测序获得牛CART启动子序列,EMBOSS、MethPrimer、New PLACE数据库分析启动子结构特征;构建4个包含不同截短长度的CART启动子报告基因载体,双荧光素酶报告基因活性检测鉴定核心启动子区;应用DNA pull down结合质谱分析(n=3),功能聚类及结合位点预测分析筛选核心启动子区候选转录因子;构建转录因子过表达载体,转染至293T细胞,分析转录因子对牛CART核心启动子区的转录调控功能(n=3)。结果表明,牛CART基因-1200 bp~+22 bp区域存在CpG岛和TATA box、CAAT box等顺式作用元件;构建的4个截短启动子报告基因载体均具有转录起始活性,-292 bp~+22 bp片段转录起始活性最强,为牛CART基因核心启动子区;转录因子RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA可与牛CART基因核心启动子区特异性结合;进一步研究证实RFX5、RFX1、TEAD4抑制CART转录(P<0.01),CREB与RELA激活CART转录(P<0.001)。本研究成功扩增获得牛CART启动子区域,筛选鉴定-292 bp~+22 bp为牛CART基因的核心启动子区,证实RFX5、RFX1、TEAD4为CART转录抑制因子,CREB、RELA为CART转录激活因子。研究结论为丰富牛下丘脑CART表达调控机制,深入研究CART调控卵泡发育机理提供依据。

牛卵泡颗粒细胞CART与候选受体的分子对接及其功能

通过同源建模预测牛卵泡颗粒细胞(GCs)可卡因-苯丙胺转录肽(CART)与候选受体ZMPSTE24的三维结构,运用分子对接技术分析二者的结合模式,探究其分子互作关系;选取3头健康成年母牛,分离GCs,转染TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24沉默序列,提取总RNA,并采用q RT-PCR检测TEDDM1、AGTR2、CMKLR1、ZMPSTE24等4个候选受体沉默后m RNA的相对表达量;采用CCK-8法测定各试验组和对照组GCs增殖情况;采用ELISA法检测各组培养液中雌激素(E2)的质量浓度,研究此4个候选受体在牛卵泡GCs中的功能。结果表明:ZMPSTE24与CART存在1个结合位点、9个盐桥、17个氢键;4个候选受体试验组的m RNA相对表达量均极显著(P<0.01)低于si NC组和空白组的,表明TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24在GCs中沉默效果良好;TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24沉默后,各试验组的细胞增殖率和培养液中E2质量浓度均极显著(P<0.01)低于阳性对照组(不加CART)的。可见,4个候选受体基因沉默后,CART对GCs增殖和E2分泌仍具有抑制作用。

西门塔尔牛无角性状的分子鉴定及应用

为鉴定西门塔尔牛有角和无角性状的相应基因型,为西门塔尔牛无角品系的培育提供数据基础,试验采集了103头无角西门塔尔牛、5头有角西门塔尔牛和5头无角安格斯牛颈静脉血,提取全血DNA后,通过PCR-测序法检测牛PC基因中P202ID突变位点的基因型。分型与测序结果显示,108头西门塔尔牛P202ID位点的基因型与角型完全一致,其中,103头无角西门塔尔牛中4头为纯合子,基因型与无角安格斯牛一致,均为PC/PC,PC的基因频率为0.0370;82头为无角杂合子,基因型为PC/prs,其中,PC的基因频率为0.7593;剩余17头去角西门塔尔牛与5头有角西门塔尔牛基因型一致,均为prs/prs,prs的基因频率为0.2037。鉴定群体中PC的基因频率为0.4166,prs的基因频率为0.5834。卡方检验结果显示,P202ID基因型与检测群体中有无角性状具有极显著关联,可以利用P202ID位点对西门塔尔牛角型进行鉴定。

计算机平面设计专业项目课程有效性探讨

计算机平面设计专业是现阶段职业教育领域中最受欢迎的专业之一,计算机平面设计专业具备较多的特点,例如实用性以及技能性等,并且计算机平面设计专业与多个领域之间存在较为密切的关联。计算机平面设计专业教师必须要对该项课程的有效性加强重视程度,让学生在学习的过程当中可以将学习时间进行良好利用,进而获取更多有益的知识。本文深入分析了职业学校计算机平面设计专业项目课程改革方面,并且针对计算机平面设计专业项目课程现状进行了探讨,然后在相关理论以及实践的基础上提出了计算机平面设计专业课程改革的有效策略,旨在能够有效提升职业学校计算机平面设计专业项目课程的有效性。

牛lncRNA SNHG12过表达载体构建

可卡因苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)是一种内源性神经肽类物质,CART广泛存在于牛卵巢中,并且对牛卵泡闭锁产生调节作用。miRNA 491可以靶向结合牛CART基因3′-UTR区域,从而调控mRNA表达极显著下调。通过ENCORI数据库预测发现lncRNA SNHG12可能作为miRNA 491的分子海绵,从而影响牛CART基因的转录调控。本试验通过构建牛lncRNA SNHG12过表达重组载体,为进一步探究lncRNA SNHG12、miRNA 491和牛CART基因三者的互作关系奠定试验基础。结果显示pcDNA3.1-EGFP-SNHG12载体序列检测正确;转染293T细胞转染效果良好。荧光定量PCR结果显示在293T细胞中NC组的lncRNA SNHG12的表达水平极显著高于miRNA 491组,试验表明pcDNA3.1-EGFP-SNHG12载体构建成功,并且lncRNA SNHG12与miRNA491具有互作作用。

牛lncRNA H19过表达载体构建

[目的]构建以及鉴定牛lncRNA H19过表达重组载体,为进一步探究lncRNA H19与miRNA 491和牛CART基因的互作关系奠定试验基础。[方法]NCBI获取牛lncRNA H19序列,经聚合酶链式反应(PCR)扩增,双酶切后载入pcDNA3.1-EGFP载体得到重组质粒。将pcDNA3.1-EGFP-H19、miRNA 491和CART 3种质粒共转染至HEK293T细胞,在细胞内反复扩增过表达之后,利用荧光定量技术检测pcDNA3.1-EGFP-H19的表达量。[结果]结果显示pcDNA3.1-EGFP-H19载体序列正确;293T细胞绿色荧光达50%,且强度适中,说明转染效果良好;lncRNA H19在293T细胞中显著表达。[结论]pcDNA3.1-EGFP-H19载体构建成功,试验将为后续探究lncRNA H19与miRNA 491和CART基因之间的互作关系创造试验条件。

蜡样芽孢杆菌发酵麦麸对蛋鸡蛋品质和血液生化指标的影响

试验旨在研究蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)发酵麦麸替代部分玉米对海兰褐商品蛋鸡蛋品质和血液生化指标的影响。将420只30周龄海兰褐商品蛋鸡随机分为4个处理组,空白对照组(CK)蛋鸡饲喂玉米-豆粕-棉粕型基础饲粮,其他组用B. cereus发酵麦麸替代为5%、10%和15%的玉米。结果表明:B. cereus发酵麦麸替代玉米为15%,平均采食量显著低于CK组(P<0.05),与CK组相比,料蛋比、产蛋率、蛋重和其他蛋品质指标无显著差异(P>0.05)。发酵麦麸组的哈夫单位高于CK组(P<0.05)。发酵麦麸组与CK组比,总蛋白、血糖、尿酸、胆固醇和甘油三酯的含量差异不显著(P>0.05)。10%和15%发酵麦麸组的白蛋白高于CK组(P<0.05)。B. cereus发酵麦麸添加量为15%对海兰褐蛋鸡生长性能和蛋品无改善作用,但未产生负面效应。

bta-miR-377琼脂糖凝胶电泳条件优化

bta-miR-377与下丘脑分泌的可卡因苯丙胺调节转录肽(Cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)存在靶向结合关系。为分析bta-miR-377在牛下丘脑组织中的表达情况,为后续探讨bta-miR-377与CART相互作用进而影响牛卵泡发育的作用机制奠定基础,经Trizol法提取牛下丘脑总RNA,采用茎环结构法设计特异性引物,并利用半定量RT-PCR技术克隆bta-miR-377,观察不同条件琼脂糖凝胶电泳后Marker和目的条带的分离情况,其中凝胶浓度为2.0%、2.5%;电压为100、80 V;时间为40、60、80 min;同时通过Image J软件对不同条件下获得的bta-miR-377条带进行灰度值分析,结合电泳结果确定最佳分离条件。结果显示,利用茎环结构法能够达到延长bta-miR-377片段的目的,且特异性强;凝胶浓度为2.5%、电压为80 V、时间为80 min时,bta-miR-377条带分离效果好且表达量高,该条件下条带的灰度值与其他组相比差异显著,与电泳分析结果一致,说明低浓度凝胶的分辨率低,长时间高压会导致DNA降解进而使条带弥散,而适当电压下电泳时间过短会使DNA分子无法聚集而使条带过宽,说明适宜的电泳条件是鉴定目的 miRNA表达的关键。综上可见,bta-miR-377在牛下丘脑中有表达,丰富了动物生殖生理学中下丘脑-垂体-性腺轴的内分泌调控理论。

bta-miR-377靶向调控牛下丘脑CART基因表达的研究

【目的】分析bta-miR-377与牛卵泡发育的关键调控因子可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)间的靶标关系,明确bta-miR-377对牛CART表达影响的作用机制。【方法】本研究通过生物信息学手段预测bta-miR-377与牛CART基因mRNA的结合位点,并对miR-377在不同物种间的序列保守性进行分析;利用双荧光素酶报告基因法验证bta-miR-377与CART基因的靶标关系;选择3头健康西门塔尔母牛,采集其下丘脑组织,分析bta-miR-377和CART基因在牛下丘脑中的内源表达情况;以PC12和293T细胞为模型进行细胞功能验证,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分别转染bta-miR-377 mimics和NC mimics后的PC12细胞中CART基因mRNA和293T细胞中CART蛋白表达丰度变化。【结果】bta-miR-377在CART 3′-UTR上存在靶向结合位点,并能极显著下调CART 3′-UTR野生型重组双荧光质粒的相对荧光活性(P<0.01),且结合位点序列在多个物种中高度保守;在牛与大鼠间,miR-377种子区序列保守性较低;bta-miR-377和CART在牛下丘脑中均有表达;过表达bta-miR-377 mimics能够极显著下调CART基因mRNA的表达(P<0.01),显著下调CART蛋白的表达(P<0.05),bta-miR-377与CART的表达存在负相关关系。【结论】bta-miR-377和CART在牛下丘脑组织中均有表达,bta-miR-377能够通过与CART 3′-UTR特异性结合抑制PC12细胞中CART mRNA的表达。

乳腺癌-冠心病共享生物标志物筛选

运用生物信息学方法筛选乳腺癌-冠心病标志物,为乳腺癌诱发的冠心病治疗提供潜在的作用靶点。从基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)中下载乳腺癌和冠心病相关表达谱芯片数据,使用GEO2R筛选差异表达基因,依据Venn图交集获取差异共表达基因,通过DAVID网站进行基因功能注释(gene ontology,GO)及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)生物功能富集分析,STRING网站和Cytoscape 3.7.2软件进行蛋白互作分析。GEPIA和Kaplan-Meier Plotter进行对乳腺癌患者hub基因mRNA表达水平和预后分析。结果表明:2个数据集筛选得到差异表达基因286个,基于在乳腺癌中mRNA显著性表达水平筛选出45个基因。GO功能富集分析发现差异表达基因主要在泛素蛋白转移酶活性、糖蛋白结合、泛素蛋白连接酶结合等生物学过程发挥作用。KEGG分析显示差异基因主要参与缝隙连接、肾素分泌、5-羟色胺能突触、谷氨酸能突触、血管平滑肌收缩、血小板活化、癌细胞蛋白多糖等多条信号通路。基因mRNA表达水平和预后分析显示NLN、POSTN、MAPT、MYO6、MAP1B、FBXO31、KIT、PIK3R1等8个与冠心病相关的hub基因参与乳腺癌的发生、发展过程。NLN、POSTN、MAPT、MYO6、MAP1B、FBXO31、KIT、PIK3R1可作为检测乳腺癌诱导冠心病的潜在标志物。

探究选煤厂集中控制系统的现状和维护方式

该文从选煤厂的集中控制系统和配置以及维护方式等方面着手,对选煤厂进行了系统的分析和对比。同时也举出了实际案例阐述选煤厂集中控制系统的现状以及应用,帮助选煤厂更好的发展。

Mimics转染PC12细胞条件的优化

PC12作为模式细胞已被广泛应用于多种疾病研究。为探究高效、低毒的PC12的细胞转染方法,试验采用化学转染法,以带有5′-羧基荧光素(FAM)标记的NCmimics作为外源基因,分别用RFect、D-Portal、Tran⁃sIntro^(TM)EL、Lipofectamine 3000和Lipofectamine 2000等5种转染试剂转染PC12细胞以筛选最佳转染试剂;然后设置NC-FAMmimics浓度为50、60、70、80、90、100 nmol/L,通过倒置荧光显微镜观察PC12细胞在最佳转染试剂下的荧光信号对转染效果进行评定。结果表明,在相同的培养条件下,不同转染试剂对PC12细胞的转染效果之间存在较大差异,其中,TransIntro^(TM)EL转染后荧光强度最高,D-Portal、Lipofectamine 3000和Lipofectamine 2000转染后荧光信号次之,RFect转染后荧光信号最弱;且不同处理对细胞损害无显著差异。以TransIntro^(TM)EL作为最佳转染试剂进一步优化NC-FAMmimics转染浓度发现,荧光强度随NC-FAMmimics浓度的增加呈现先增强后降低的趋势,且在NC-FAMmimics浓度为70 nmol/L时荧光信号最强;此外不同浓度下的细胞数量无显著差异。综上可见,以TransIntro^(TM)EL作为转染试剂、NC-FAMmimics浓度为70 nmol/L时,转染后PC12细胞荧光强度最高,转染效果最好。

牛下丘脑lncRNA SNHG3的筛选及其调控CART表达的功能鉴定

本研究旨在筛选调控牛下丘脑可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)表达的长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)小核仁RNA宿主基因3 (small nucleolar RNA host gene 3,SNHG3),明确lncRNA SNHG3调控牛下丘脑CART表达的作用机制。利用Star Base v2.0、NCBI、DIANA tools数据库预测分别与极显著抑制CART表达的miR-381、miR-491存在靶向关系的lncRNAs,分析其结合位点;选取3头健康成年西门塔尔母牛,提取其下丘脑组织总RNA,通过半定量RT-PCR技术鉴定所筛选的lncRNAs内源表达情况;双荧光素酶报告基因技术检测miR-381/491与lncRNAs间的靶向结合关系;构建lncRNAs、CART过表达载体及miR-381/491 mimics,分别转染至293T细胞,分析lncRNAs对CART基因表达的调控作用机制;利用动物活体实验对在细胞水平调控作用效果最强的lncRNA进行功能分析。lncRNA TUG1、SNHG3与miR-381存在结合位点,lncRNA H19、SNHG12、DANCR与miR-491存在结合位点,且lncRNA TUG1、SNHG3、H19、SNHG12、DANCR均在牛下丘脑中有表达;双荧光素酶检测结果显示,miR-381显著抑制TUG1-WT重组荧光质粒的相对荧光活性(P<0.05),极显著抑制SNHG3-WT重组荧光质粒的相对荧光活性(P<0.01);miR-491显著抑制DANCR-WT和H19-WT的荧光素酶活性表达(P<0.05),极显著抑制SNHG12-WT荧光素酶活性表达(P<0.01);在细胞水平,lncRNA SNHG3通过特异性结合miR-381极显著提高CART表达(P<0.001),lncRNA SNHG12通过特异性结合miR-491极显著提高CART表达(P<0.01),其中,lncRNA SNHG3调控CART表达效果最强;动物实验结果表明,lncRNA SNHG3通过特异性结合miR-381显著提高CART m RNA和蛋白表达。本研究证实了lncRNA SNHG3作为miR-381的竞争性内源RNA (competing endogenous RNAs,ce RNA),在转录和转录后水平均显著上调CART表达,为进一步研究牛下丘脑CART的分子网络调控机制奠定了基础。