通过DNA shuffling技术获得初步解除苯丙氨酸反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(AroG)突变株

aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase,AroG)是苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)合成途径中的关键酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸反馈抑制的突变AroG,分别以Escherichia coli(E.coli)野生型和突变型aroG基因以及Sal monella typhi mnrium(S.typhi mnrium)野生型aroG基因为亲本,通过DNA suffling技术对aroG进行改组,获得的改组分子与载体pET30a连接得到改组文库,转化到E.coliBL21(DE3)中,在含有Phe类似物对氟苯丙氨酸(p-FP)的培养基上筛选转化子,获得4个解除Phe反馈抑制的克隆.

利用DNA shuffling构建部分解除对氟苯丙氨酸反馈抑制的aroG

3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPs)是芳香族氨基酸生物合成途径中关键的限速酶,在大肠杆菌中有3种同工酶,分别由aroG(Phe)、aroH(Trp)和aroF(Tyr)基因编码,这3种酶分别受苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸反馈抑制的突变AroG,以Escherichia coli野生型aroG、aroH和aroF基因为亲本,通过DNAshuffling技术对aroG基因进行改组,将获得的改组aroG与载体pET30a连接得到改组文库,转化到E.coliBL21(DE3)中,在含有Phe类似物对氟苯丙氨酸(p-FP)的培养基上筛选转化子,获得2个能耐受10 mg/mLp-FP的克隆.这2个克隆的测序结果显示,其中一个发生了3个点突变:C129T,A531G,A1032G;另一个发生了3个点突变T77A,G883A,A1032G和4个碱基的插入突变即922位插入A,943位插入CG,971位插入A.2个改组AroG的最适pH和最适温度与野生型AroG相比无明显变化.