患呼吸道疾病羊鼻腔及生活环境微生物多样性分析

本研究旨在了解患呼吸道疾病羊鼻腔及其所在羊舍地面表层堆积物的微生物多样性,分析羊患呼吸道疾病与羊生活环境中菌群结构之间的联系,为羊呼吸系统疾病的预防和治疗提供参考。本课题采集宁夏回族自治区银川市某羊养殖场羊鼻腔拭子及羊舍地面表层堆积物,以健康羊鼻腔拭子及健康羊所在羊舍地面表层堆积物为对照,进行16S rRNA基因测序,通过生物信息学技术分析健康羊鼻腔及其生活环境与患呼吸道疾病羊鼻腔及其生活环境中微生物菌群的群落结构及多样性。结果显示:与健康羊鼻腔及其生活环境中微生物相比,患呼吸道疾病羊鼻腔及其生活环境中微生物菌群的多样性和丰富度均降低。健康羊鼻腔与患呼吸道疾病羊鼻腔具有不同的群落结构,二者之间具有极显著的差异(P<0.01),寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)是健康羊鼻腔中主要的菌属,莫拉菌属(Moraxella)、伯杰菌属(Bergeyella)和丝状杆菌属(Filobacterium)是患呼吸道疾病羊鼻腔中的优势菌属。此外,支原体属(Mycoplasma)、波氏杆菌属(Bordetella)和曼氏杆菌属(Mannheimia)等细菌性病原在患呼吸道疾病羊鼻腔的相对丰度也明显增加。健康羊所在羊舍地面表层堆积物与患呼吸道疾病羊所在羊舍地面表层堆积物的菌群结构也具有显著差异(P<0.05),厚壁菌门(Firmicutes)是患呼吸道疾病羊所在羊舍地面表层堆积物中的优势菌门。结果提示,患呼吸道疾病羊鼻腔及其生活环境中微生物菌群结构及空间分布发生了显著变化,但羊生活环境中微生物群落结构与羊患呼吸道疾病无直接关联,患呼吸道疾病羊鼻腔中莫拉菌属、伯杰菌属和丝状杆菌属等病原菌相对丰度的增加及微生物菌群失衡可能是导致羊患呼吸道疾病的重要因素。

18β-甘草次酸哌嗪衍生物抗肝癌SMMC-7721细胞活性研究

目的研究18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35对SMMC-7721细胞增殖的的抑制作用及对凋亡的影响。方法用18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35以不同浓度、不同时间段处理SMMC-7721细胞,显微镜下观察其对肝癌SMMC-7721细胞形态结构的影响;MTT法检测18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35对SMMC-7721细胞的增殖抑制率;Hoechst-33258细胞凋亡染色试剂盒检测细胞凋亡情况;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果MTT检测结果表明,18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35能够抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖,且呈浓度依赖性(P<0.05);流式细胞仪检测细胞凋亡率,D35为26.71%、D34为36.95%。结论 18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35对SMMC-7721细胞有增殖抑制作用和促凋亡作用,且优于18β-甘草次酸(GA)。

玉米成熟胚愈伤诱导及再生体系建立

合适的受体材料是玉米成功转化的关键,本实验试图通过成熟玉米来诱导愈伤,为转化提供材料。选取生产上常用的几个玉米系为材料,参考相关文献,摸索组织培养条件将成熟胚诱导愈伤,来获得再生植株。

结核分枝杆菌Erp蛋白PGLTS的4基序突变体的构建

以结核分枝杆菌H37Ra DNA为模板,通过PCR扩增,获得靶基因erp片段。采用重叠延伸PCR的方法得到erp基因PGLTS的4基序的突变体,依次删除突变体的C-末端、N-末端和C/N-端,构建重组质粒p ET28a-C4、p ET28a-N4、p ET28a-CN4,转化BL21(DE3)p Lys S。对重组菌株IPTG诱导后的表达产物进行Tricine SDS-PAGE,得到大小分别约为11.2、15.4、4.8 ku的目的蛋白。Western blotting分析结果表明,目的蛋白表达特异。

利用基因工程技术提高玉米赖氨酸含量的研究进展

玉米是重要的粮食和饲料作物,但玉米中赖氨酸含量较低,降低了其营养品质及蛋白利用率。常规育种的方法提高玉米赖氨酸含量收效甚微,随着生物技术的不断发展,基因工程技术的不断进步,为提高玉米赖氨酸含量,改良玉米品质提供了一条新的技术路线。综述了近年来利用基因工程技术提高玉米赖氨酸含量的研究进展以及对未来的展望。

宁夏回族人群TCF7L2基因rs290487位点多态性与2型糖尿病的关联性分析

目的:探讨宁夏地区回族人群中转录因子7类似物2(TCF7L2)基因rs290487位点多态性与2型糖尿病(T2DM)的关联性,阐明TCF7L2基因是否为T2DM的易感基因。方法:选择宁夏回族自治区111例T2DM患者(T2DM组)和109名健康对照者(对照组),采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCRRFLP)方法检测2组研究对象的TCF7L2基因rs290487位点的基因型和等位基因频数分布;2组研究对象基因型频数、等位基因频数分布的差异分析采用χ2检验。结果:TCF7L2基因rs290487位点共检测到3种基因型TT、CT和CC;2组研究对象TCF7L2基因rs290487位点的基因型频数分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05);2组研究对象基因型频数的分布比较差异无统计学意义(χ2=5.370,P>0.05);2组研究对象等位基因频数分布比较差异亦无统计学意义(χ2=0.034,P>0.05)。结论:在宁夏回族人群中,TCF7L2基因rs290487位点多态性与T2DM的发生无关联,TCF7L2基因可能不是T2DM的易感基因。

STING蛋白在绵羊原代肺泡巨噬细胞的表达与生物信息学分析

干扰素刺激因子(STING)作为近年来发现的固有免疫信号通路里的关键蛋白,在机体抵抗病原体侵入过程中发挥着重要的作用。为了探究绵羊原代肺泡巨噬细胞中是否存在STING蛋白并研究其在该细胞中的定位,本研究分离了绵羊原代肺泡巨噬细胞,通过RT-PCR方法检测,结果显示扩增到了目的条带,表明绵羊原代肺泡巨噬细胞中含有sting基因;western blot结果显示在40 ku处有目的条带,进一步明确了STING蛋白在绵羊原代肺泡巨噬细胞中的表达;利用间接免疫荧光试验检测STING蛋白的定位,结果显示STING蛋白与内质网特异性标记蛋白ERp72相重叠,初步明确了绵羊原代肺泡巨噬细胞中的STING蛋白定位在内质网中;并对绵羊原代肺泡巨噬细胞中的STING蛋白进行了生物信息学分析。本研究为深入探究STING蛋白在绵羊肺泡巨噬细胞中发挥固有免疫的相关机制奠定基础。

猪肺脏气道上皮干细胞的特异抗体筛选与抗原表达研究

猪肺脏气道上皮主要由基底细胞,克拉拉细胞,纤毛细胞,杯状细胞等上皮细胞类型组成,筛选猪气道上皮干细胞的相关特异性抗体,观察其特异抗原的表达,将有助于对猪气道上皮干细胞的分离、鉴定和生物学特性的研究。试验中,制备远端气道上皮细胞的冰冻切片与细胞爬片,利用免疫荧光染色法,分析不同物种来源的抗体对猪气道上皮细胞的免疫染色反应;同时利用Oct3/4、Sox2、CD133和SSEA-1等10种上皮干细胞相关抗体分析猪气道上皮干细胞表面抗原表达情况。通过试验,筛选出在猪气道上皮干细胞相关抗体,并发现气道组织冰冻切片未检测到这10种抗体相关的阳性细胞,而在细胞爬片中观察到CD49f和CD117阳性细胞数量较多。免疫荧光共染发现这些CD49f和CD117阳性细胞同时也表达基底细胞表面标记Keratin 14。这可能是正常情况下猪气道上皮干细胞数量极为稀少,表面抗原表达量低而不易检测到,在肺脏气道上皮受到外环境刺激时(如消化),上皮干细胞开始增殖以完成损伤修复作用发生数量上的增殖。综上所述,利用Keratin 14和CD49f或CD117(c-kit)双标染色法可以鉴定猪肺脏气道上皮干细胞的候选亚群来用于其生物学特性与功能的研究。

甘草酸检测试剂盒的组装与效果评价

目的:研制甘草酸间接竞争酶联免疫试剂盒。方法:通过棋盘滴定法确定了抗原最佳包被浓度为1μg/m L,一抗稀释度为1:8000,并以此成功组装了甘草酸快速检测试剂盒。结果:使用试剂盒检测了甘草酸样品,并与HPLC测定结果进行对比,发现灵敏度有了显著提高,达到了纳克级别。试剂盒的回收率高于96%,变异系数低于4.5%。结论:开发出的试剂盒稳定性良好,不同批次产品间检测值没有显著差异,有效的缩短了检测时间和检测成本,为甘草酸快速检测提供了一种新方法。

猪肺炎支原体的免疫原蛋白及疫苗的研究进展

猪肺炎支原体是引起猪支原体肺炎的主要病原,严重危害着养猪业的发展。本文综合国内外猪肺炎支原体主要免疫原及疫苗的研究进展,从而为猪肺炎支原体致病机理的进一步研究及该病的防治提供新思路。

c-di-AMP——细菌中第二信使的研究进展

环二腺苷酸(cyclic diadenylate monophosphate,c-di-AMP)是新发现的在细菌中广泛存在的一类重要的第二信使。c-di-AMP不仅与细菌的生长、细胞壁的代谢平衡、生物被膜的形成等密切相关,还在真核宿主细胞抗感染的固有免疫中发挥重要作用。主要从c-di-AMP的合成酶与降解酶、c-di-AMP在病原菌中的结合蛋白以及c-di-AMP与宿主细胞互作过程中的相关受体蛋白等几方面进行综述。

宿主感染马红球菌的免疫机制

马红球菌(Rhodococcus equi)作为一种人兽共患病原菌,主要引起3~6月龄马和免疫缺陷患者肺部相关疾病,病死率为50%~80%;此外还可以感染猪、羊、猫、狗、骆驼等动物。该菌不仅对马业造成严重经济损失,还危害免疫缺陷患者的健康,因此在世界范围内受到公共卫生学的重视。马红球菌感染宿主后,其通过抑制吞噬体/自噬体与溶酶体的融合抵抗巨噬细胞杀伤从而进行免疫逃逸;此外,由于马驹固有免疫和适应性免疫存在功能缺陷使其不能有效抵抗马红球菌感染。目前关于宿主感染马红球菌的免疫机制尚未阐述清楚,从马红球菌与宿主免疫细胞相互作用的角度出发,就宿主感染马红球菌的免疫机制进行综述,以期更好地了解马红球菌感染的免疫机制,同时为该菌所引发疾病的防治策略提供参考。

宿主细胞感染支原体后的“宿命”

支原体(Mycoplasma)是介于细菌与病毒之间的一类原核微生物,无细胞壁,依靠细胞膜维持其个体形态和多种生理功能。临床上,支原体可引起动物和人类多种疾病,严重影响畜牧业的发展,威胁人类健康,但是目前针对支原体疾病的抗生素治疗效果不佳、疫苗有效性较差,且缺乏较为敏感的诊断工具,加之支原体个体微小、生长缓慢,暂缺乏有效的研究手段,其感染宿主细胞的分子机制仍不清楚,因此,至今支原体引起的疾病很难预防和控制。随着人们对支原体感染宿主细胞机制愈发关注,并取得了一些进展,本文就支原体感染后诱导宿主细胞的凋亡、自噬、癌变等方面进行概述,以期对支原体致病机制的研究提供帮助。

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。

牛支原体与无乳支原体的相似性比对分析

运用生物信息学方法对牛支原体(Mycoplasma bovis)和无乳支原体(Mycoplasma agalactiae)的相似性进行多重比对分析。使用Mega 7、Clustal a、Sibeilia等生物信息学软件对M.bovis与M.agalactiae的全基因组、16S rRNA、脂蛋白家族进行相似性比对分析。通过多重比对发现,M.bovis与M.agalactiae在全基因、16S rRNA、以及脂蛋白家族方面均表现出较高的相似性。

STING信号通路的研究进展

干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon gene,STING)作为固有免疫系统的关键性接头蛋白,在外源或内源DNA介导的免疫应答中发挥重要作用,广泛参与宿主体内的多种信号传导过程。概述了STING信号通路分子机制及其在抗病毒感染、自身免疫疾病、神经系统疾病和肿瘤中的作用,介绍了常见的STING激动剂和抑制剂,以期为STING的进一步研究提供参考。

乳腺癌及癌旁组织中VEGF及survivin-2B mRNA的表达意义

目的:观察乳腺癌及癌旁组织中VEGF及survivin-2B mRNA表达情况,并探讨其与临床病理学指标的关系.方法:以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测60例乳腺癌及癌旁5cm正常乳腺组织标本VEGF及凋亡抑制因子sur-vivin剪接体survivin-2B mRNA表达,半定量分析电泳结果.结果:在60例乳腺癌标本中VEGF及survivin剪接体survivin-2B mRNA均高表达,与癌旁正常乳腺组织中差异有统计学意义(P<0.01),VEGF mRNA及survivin-2B在乳腺癌组织中的高表达呈正相关(r=0.576,P<0.05),同时VEGF及survivin-2B mRNA的表达与淋巴结转移有关(r=0.482,P<0.05).结论:VEGF及survivin-2B因子为乳腺癌发生、发展过程中的重要因子,可对患者的治疗及预后作预测.

胞质DNA感受器cGAS的研究进展

环磷酸鸟苷-腺苷合酶(cGAS)是新发现的一种DNA感受器,活化的cGAS催化第二信使——环磷酸鸟苷酸腺苷酸(cGAMP)的合成,cGAMP与干扰素基因刺激分子(STING)结合激活天然免疫信号通路。cGAS不仅可以诱导自噬,还可识别错误定位的DNA,是将其监测为危险相关分子模式(DAMP)并诱导Ⅰ型IFN和其他细胞因子表达的传感器,并且cGAS在DNA损伤、细胞衰老、肿瘤等中也发挥重要作用,因此本文对cGAS及其功能的最新研究进展进行综述。

绵羊肺炎支原体对肺上皮细胞自噬影响的研究

自噬是一种广泛存在于真核细胞中的生理现象,在维持细胞稳态及抗感染免疫过程中发挥着重要作用。但是,绵羊肺炎支原体(MO)与细胞自噬的关系尚不明确。为研究MO感染宿主呼吸道上皮细胞后是否发生细胞自噬,本实验以小鼠肺脏上皮细胞TC-1为研究对象,经RT-PCR检测MO(MOI 10)感染TC-1细胞后不同时间自噬相关基因的转录水平。结果显示,与感染前相比自噬相关基因LC3I、LC3II、P62及Atg7的转录水平均显著上升(p<0.05),并且在感染6 h转录水平最高(分别上升1.8倍、1.5倍、1.6倍和2.3倍);Western blot检测MO感染TC-1细胞后不同时间自噬相关蛋白的表达。结果显示,与感染前相比,LC3II、P62及Atg7的蛋白表达水平均显著上升(p<0.05),并且在感染12 h蛋白表达量最高(分别上升2.4倍、5.8倍、3.1倍)。以上结果从转录水平和蛋白水平均表明MO能引起TC-1细胞的自噬。利用腺病毒mRFP-GFP-LC3转染TC-1细胞24 h后感染MO,6 h、12 h、24 h后分别经荧光显微镜观察细胞内绿色和红色斑点的变化,监测MO诱导的细胞自噬流。结果显示,与未感染组相比,MO感染TC-1细胞内有更多的黄色(红色和绿色斑点叠加,表示自噬体)和红色斑点(p<0.05),并且随着感染时间的延长红色斑点增多,表明MO可诱导TC-1细胞形成完整的自噬流。通过siRNA技术沉默TC-1细胞中P62和Atg7基因的表达,利用western blot检测该两个基因沉默后细胞中LC3II蛋白的表达。结果显示,MO分别感染P62和Atg7沉默后的TC-1细胞12 h时,LC3II蛋白表达量均显著下降(p<0.01),表明P62、Atg7基因沉默后,抑制了MO诱导的细胞自噬。MO分别感染P62及Atg7基因沉默后的TC-1细胞,利用变色单元(CCU)试验检测MO的增殖。结果显示,MO在P62或Atg7基因沉默后的TC-1细胞中的增殖能力均显著增强(p<0.05),表明自噬对MO在TC-1细胞中的增殖起到一定的抑制作用。本实验为进一步揭示MO的感染机制提供新的研究思路,也为该病的治疗提供参考依据。

胞外和胞内菌胞外囊泡的功能及应用

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是从细胞膜上脱落或者分泌的双层膜结构的囊泡状小体。真核生物、细菌、古细菌和支原体等具有细胞结构的生物均能够释放EVs。细菌分泌的EVs含有DNA、RNA及蛋白质等多种成分,其在细菌毒力保持、免疫逃逸、细菌间物质运输、宿主细胞免疫调节、宿主转录基因调节、耐药性等方面发挥巨大作用。细菌可以分为胞内菌(Intracellular bacteria)和胞外菌(Extracellular bacteria),二者EVs在释放机制、生理学功能和临床应用等方面存在着区别与联系。就胞内菌和胞外菌的囊泡分泌机制、功能及应用作一阐述。