复合稳定剂对碱性蛋白酶的作用研究

通过单因素实验得出了对碱性蛋白酶稳定效果较好的几种保护剂:5 mmol.L-1Ca2+;20 mg.mL-1微胶粒抑制剂丙二醇-单甲醚;0.01%(质量体积比)可逆蛋白酶活性抑制剂4-甲酰苯基硼酸;1%甘油。在此基础上,进行L18(37)正交实验,以相对酶活率为指标,考察了不同酶活性保护剂在不同条件下对液体碱性蛋白酶活力的影响,筛选到一种优质高效的碱性蛋白酶稳定剂配方为:5 mmol.L-1Ca2+,15 mg.mL-1丙二醇-单甲醚,0.015%4-甲酰苯基硼酸,1%甘油。加入液体碱性蛋白酶40℃保存15 d后,相对酶活力仍保持在85%以上。

高活力碱性蛋白酶产生菌的选育与发酵放大

为了选育高活力碱性蛋白酶产生菌株。采用复合诱变(紫外照射、NTG、离子注入)方法,结合平板初筛与摇瓶复筛。获得一株高产突变株HAPN-169,其酶活力为3.5×10u/mL。高产菌株HAPN-169根据气液接触中体积传氧系数kLa相同的原则发酵放大(7L,30L,200L),其发酵参数为:温度34℃,装液系数0.7,接种量5%,使溶氧维持在20～30%,控制发酵过程pH不低于7.0。在7L发酵罐,发酵时间为54小时,酶活力为3.6×104u/mL;在30L发酵罐,发酵时间为50小时,酶活力为3.86×104u/mL;在200L发酵罐,发酵时间为36小时,酶活力为4.2×104u/mL。发酵液pH在7.5左右时,酶活力在峰值,发酵终点一到,必须马上下罐。该结果对为我国碱性蛋白酶工业发展提供一定的基础。

嗜碱性芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶分别在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达

从Bacillus alcalophillus PB92中扩增出碱性蛋白酶基因Mapr,Mapr分别插入到大肠杆菌载体pET-22b(+)和枯草芽孢杆菌载体pWB980中构建成重组分泌型表达载体pET22b(+)-Mapr、pWB980-Mapr。碱性蛋白酶基因分别在大肠杆菌宿主BL21和枯草芽孢杆菌DB104中得到表达。SDS-PAGE分析,重组蛋白酶的分子量为28kD。在大肠杆菌,所得酶活为231U/ml,而在枯草芽孢杆菌,其酶活为1563U/ml。大概是由于碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌折叠成熟机制与大肠杆菌的不同造成的。