镉胁迫下构树qRT-PCR内参基因筛选及验证

[目的]筛选出镉(Cd)胁迫下构树中稳定表达的内参基因,为后续开展构树耐Cd的分子机理研究奠定基础。[方法]以Cd胁迫下构树的根和叶组织为材料,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测10个候选基因(BpUBE2、BpRPL8、BpActin、BpGAPDH、BpHSP、BpTUA、BpDOUB、Bpβ-TUB、BpHIS、BpNADH)的表达情况,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder分析软件对候选内参基因的表达稳定性进行综合评估,并通过逆境胁迫响应基因BpDREB验证筛选出的内参基因的稳定性。[结果]BpDOUB和BpNADH在Cd胁迫下构树中基因表达相对稳定,BpGAPDH表达稳定性最差。以Bp-DREB验证内参稳定性时发现,单独或组合使用BpDOUB及BpNADH为内参基因时,BpDREB基因表达水平显示出相似的趋势,而稳定性较差的BpGAPDH基因未能对BpDREB的表达量进行准确校正。[结论]Bp-DOUB、BpNADH基因以及BpDOUB+BpNADH基因组合均可作为合适的内参基因,提高Cd胁迫下构树相关基因表达分析的可靠性。

北美鹅掌楸YABBY转录因子家族的鉴定与表达分析

【目的】YABBY转录因子家族仅存在于种子植物中,对植物的早期胚胎发育、果实发育、次生代谢物合成、逆境应答、侧生器官分化和背腹极性建立等方面均具有重要作用,而目前对鹅掌楸属植物的YABBY家族基因的研究较少。为了解北美鹅掌楸YABBY家族的成员和特征,对其成员进行了鉴定、亚细胞定位及表达模式分析等研究工作。【方法】从北美鹅掌楸花器官转录组中筛选出YABBY家族基因序列,采用RACE扩增技术获得了其中2个差异表达基因的全长,分别命名为LtYABBY1,5,并对他们进行生物信息学分析。随后,利用RT-qPCR检测LtYABBY1,5在北美鹅掌楸的根、茎、叶、花芽、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊等8个组织中的表达水平。最后,通过烟草瞬时转化体系对LtYABBY1,5蛋白进行进一步亚细胞定位分析。【结果】在北美鹅掌楸中共鉴定出6个YABBY成员,分别属于YABBY1/FILAMENTOUS FLOWER(FIL)、YABBY2、YABBY5亚族,外显子数量均为7个。克隆所得其中2个基因LtYABBY1,5,全长分别为1255、1078 bp,编码了210、188 aa,生物信息学分析结果显示,两者均为亲水蛋白与非跨膜蛋白。RT-qPCR试验发现LtYABBY1整体表达水平较高,尤其是在北美鹅掌楸的花芽和雌蕊中高表达,而LtYABBY5整体表达水平较低,仅在叶片、花芽、雌蕊和萼片中有少量表达。亚细胞定位分析结果表明,LtYABBY1,5蛋白定位于细胞核,与预测结果基本一致。【结论】北美鹅掌楸YABBY成员较少,其中LtYABBY1在花芽中特异表达,基于上述结果,推测该基因可能参与了北美鹅掌楸花芽的早期分生组织的发育调控。

北美鹅掌楸人工林生长规律及早期选择可行性探究

[目的]北美鹅掌楸为优良的珍贵用材树种,研究其生长发育规律及生长性状早晚期相关对于北美鹅掌楸人工林高效培育有重要的指导意义。[方法]本文利用树干解析的方法对江苏句容24年生的北美鹅掌楸人工林生长规律研究,并在此基础上进行胸径、树高和材积性状的年年相关分析以及早期选择效率评价。[结果]研究结果表明:北美鹅掌楸胸径、树高从6 a进入快速生长期,持续到17 a,而材积则在1 10 a增长缓慢,12 a后进入速生期,生长速率在20 a达到最大,22 a后逐渐降低,林分接近数量成熟。生长性状的年年相关及早期选择效率分析结果表明:胸径、树高在6 a与18 a显著相关,材积在6 a与16 a达到显著相关,且此时选择效率最高;若以24 a为伐期年龄早晚相关分析,胸径、材积在16 a与24 a生长量达到显著相关水平,而树高则为14 a。[结论]北美鹅掌楸胸径、树高早期增速较快,进入中壮龄阶段竞争加剧,个体间分化增大。随着林分年龄的增长,研究获得的早期选择年龄也相应地延迟。从加速育种角度,在6 a进行早期选择较为合理,而在培育大径材北美鹅掌楸方面可以16 a之后再进行疏伐选择。

西番莲解剖结构特征及低温胁迫下叶片结构与抗寒性的关系

低温胁迫是影响西南喀斯特地区植物生长发育及产量效益的重要因素。为探明西番莲不同品种在生理结构上是否存在差异以及它们在低温胁迫下适应性存在差别的原因,以2个品种及4个基因型的一年生西番莲扦插苗标准株为研究对象,常温下解剖根、茎、叶、花、果实及种子,观察形态结构;并观察2个品种西番莲叶片在不同低温胁迫下的解剖结构,研究叶片形态结构与其抗寒性的关系。结果表明:抗寒品种(平塘1号)及抗寒基因型(黔乡香1、2、3、4号)和不抗寒品种(紫香1号)的解剖结构只在叶片木质部维管束的形态构造上存在明显区别。不同梯度(5. 0、2. 5、0、-2. 5℃)低温胁迫处理后,紫香1号的叶片在未受到冻害损伤前(-2. 5℃处理下紫香1号叶片损伤明显),其长度、宽度和厚度均显著大于平塘1号;紫香1号未明显损伤的低温胁迫处理下,2个品种的蜡质层厚度十分接近,无显著性差异; 2个品种的叶脉维管束长度及宽度无明显变化;紫香1号可承受的低温(5. 0℃)处理下,2个品种叶脉厚度及栅栏组织长度无显著差异,但在紫香1号受冷害的低温(2. 5℃)及更低的冻害温度(0℃和-2. 5℃)下,平塘1号的叶脉厚度和栅栏组织长度极显著大于紫香1号; 2个品种的海绵组织厚度均随着温度的降低不断增加,平塘1号的海绵组织厚度始终小于紫香1号; 2个品种的组织结构紧密度及叶脉突起度均呈显著或极显著差异,随着胁迫温度的不断降低,平塘1号的组织结构紧密度及叶脉突起度的增大比例大于紫香1号; 2个品种的组织结构疏松度在紫香1号明显受冻害前呈显著或极显著差异,受叶片本身大小及厚度影响,平塘1号的组织结构疏松度大于紫香1号。综上所述,抗寒性较强的平塘1号的叶片长、宽较小,叶片较薄而叶脉厚,栅/海比较高,组织结构紧密度及叶脉突起度大;不抗寒品种紫香1号则反之。

鹅掌楸AOX家族基因克隆与组织表达分析

鹅掌楸(Liriodendron chinense)为重要的珍贵用材及园林观赏树种,开展抗逆基因的研究,对于提高鹅掌楸适应性有重要意义。该文以鹅掌楸为研究对象,通过采用RT-qPCR与RACE相结合的方法克隆获得3个AOX基因,其ORF长分别为858、1032、1044 bp,相应编码氨基酸数为285、343、347 aa,分别命名为LcAOX1a、LcAOX1b和LcAOX2。蛋白同源性分析发现鹅掌楸AOX家族蛋白序列高度保守,尤其在C端保守性极高,且均含有“EXXH”、“EEE-Y”铁离子结合保守结构域。亚细胞定位分析结果显示LcAOX1a蛋白定位于线粒体及叶绿体之外的其他位置,LcAOX1b蛋白在叶绿体和线粒体中均有定位,LcAOX2蛋白定位于线粒体基质。采用RT-qPCR方法研究AOX基因在鹅掌楸茎、叶片、叶芽、花芽、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊8个不同组织中的表达模式,分析发现鹅掌楸AOX基因在花器官中表达量明显高于营养器官,LcAOX1a与LcAOX1b基因在雄蕊中表达量最高,特别是LcAOX1a基因在雄蕊中特异性表达,其表达量远远高于其他组织;LcAOX2基因在花瓣中表达量最高。该研究克隆3个鹅掌楸AOX基因并进行相关分析,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

北美鹅掌楸CPP转录因子家族LtTCX2基因的克隆与分析

CPP(cystein-richpolycomb-likeproteinor Tesmin/TOS1-like)家族属于成员数目较少的一类转录因子基因家族,含有保守的富含Cystein的CRC结构域,在植物发育进程中,主要参与花发育、细胞分裂、分子进化等。为了探索CPP转录因子家族在北美鹅掌楸花发育中的作用,该文以北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)为材料,采用RACE技术克隆出1个CPP-like家族基因,命名为LtTCX2,全长2866 bp。通过NCBI网站在线分析,ORF长2424 bp,编码了807个氨基酸,含2个保守的TSO1-like CXC结构域,分子量为88699.25 Da,理论等电点为5.83,不稳定系数为62.38,疏水性平均值为-0.619,预测为亲水性蛋白、非跨膜蛋白、核蛋白,不含信号肽及切割位点。氨基酸比对及系统进化分析结果显示,LtTCX2与其他物种的CPP家族TCX蛋白具有较高的同源性,与亚洲莲(Nelumbo nucifera)的NnTCX2、胡杨(Populus euphratica)的PeTCX2进化关系最近。荧光定量PCR结果显示,LtTCX2基因在叶片中表达量最高,在萼片、花瓣中几乎不表达,表达量由高至低如下:叶片、花芽、雌蕊、雄蕊、茎、根、花瓣、萼片。以上结果说明,LtTCX2属于较古老、保守的一类基因,可为从分子生物学层面研究鹅掌楸属植物系统进化提供一定的理论依据。

鹅掌楸LcUGE基因的克隆和组织表达分析

为了解鹅掌楸(Liriodendron chinense)的UGE基因功能,采用RACE和EPIC-PCR技术克隆到2个UGE基因,命名为LcUGE1和LcUGE2。结果表明,LcUGE1基因的c DNA全长为1 531 bp,包含1 050 bp的开放阅读框,编码349个氨基酸, gDNA长度为11 920 bp;LcUGE2基因的c DNA长度为1 378 bp,包含1 056 bp的开放阅读框,编码351个氨基酸,g DNA长度为6544 bp。LcUGE1和LcUGE2基因均含有9个外显子和8个内含子,且外显子长度和内含子剪切位点序列几乎一致,但内含子片段长度存在显著差异。编码的LcUGE1和LcUGE2蛋白高度保守,保守性达到82%。LcUGE1基因在雄蕊中表达量最高,而LcUGE2基因则在花萼中表达量最高。这表明LcUGEs基因可能参与鹅掌楸的生殖发育过程。

北美鹅掌楸CCD1基因的克隆与表达分析

本研究以北美鹅掌楸为试验材料,从北美鹅掌楸和鹅掌楸转录组数据库中挖掘出37条CCD基因家族的EST序列,并将这些序列归类于CCD基因家族中。以其中一条预测为CCD1的EST序列为基准设计引物,通过反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速扩增(RACE)技术从北美鹅掌楸中克隆得到一条全长为1 929 bp的序列,命名为LtCCD1基因。该基因包含102 bp 5'端、177 bp 3'端非翻译区序列和1 650 bp的开放阅读框,共编码549aa。LtCCD1基因与多个物种CCD1基因相似度大于80%,其编码的蛋白质拥有CCD基因家族典型的结构域RPE65。系统发育分析发现,LtCCD1基因编码的蛋白质与Anthurium amnicola、Crocus ancyrensis和番红花的CCD1基因编码的蛋白质亲缘关系较近。LtCCD1蛋白质分子量为61.96 kD,等电点为6.10,属酸性蛋白;无规则卷曲是该蛋白质二级结构的主要成分。利用在线软件Target P进行亚细胞定位预测并结合CCD1蛋白在其它植物中的定位信息,推测该蛋白可能位于细胞质内。使用实时荧光定量PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析,发现LtCCD1基因在北美鹅掌楸的花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊、花芽、叶、叶芽、茎8个组织中均有表达,表达量从大到小的顺序依次为:叶、花萼、花瓣、茎、雌蕊、叶芽、花芽、雄蕊。该研究结果可为进一步分析北美鹅掌楸中CCD1基因的功能奠定基础。

鹅掌楸LcKNOX3转录因子基因全长克隆及组织表达特异性分析

KNOX基因是一类同源异形盒Homeobox gene转录因子家族基因,在植物的生长发育过程中发挥重要作用并与植物形态建成密切相关。本研究利用RACE技术从鹅掌楸叶芽中克隆出1个KNOX基因的全长序列,并将该基因序列与拟南芥KNOX类基因进行比对。通过生物信息学分析预测该基因的开放阅读框(ORF)以及对基因编码蛋白结构进行分析,与其他物种的同类基因进行同源性比对,构建系统进化树;同时,采用qReal Time-PCR技术对该基因进行鹅掌楸组织表达特异性分析。结果表明,LcKNOX3基因全长1 732 bp,开放阅读框(ORF)长945 bp,编码314个氨基酸,蛋白分子量为34 848.89 kD,等电点(pI)为5.51,不稳定系数为47.52,归类为不稳定蛋白,编码蛋白结构具有4个TALE蛋白家族的保守结构域。BLAST比对结果显示,该基因与拟南芥KNAT3基因相似度最高,将其命名为LcKNOX3。利用Phyre2软件预测该基因编码蛋白的结构,发现与Homeodomain-like蛋白最为相似,系统进化树分析发现与凤梨(Ananas comosus)进化关系较近。根据组织表达特异性分析结果,发现LcKNOX3基因在鹅掌楸的花瓣和茎中的表达量最高,从高到低的顺序为:花瓣>茎>雄蕊>雌蕊>芽>花芽>叶。本研究结果可为鹅掌楸形态建成相关基因的鉴定提供参考依据。