东北黑斑蛙皮肤抗菌肽的分离及抗菌活性检测

从成年及幼年两组东北黑斑蛙皮肤分泌物中分离抗菌肽,并对其抗菌活性进行检测。采用电刺激法,收集黑斑蛙皮肤分泌物,应用反相高效液相色谱仪进行分离,应用MALDI-TOF/TOF质谱仪鉴定,通过最小抑菌浓度(MIC)试验,检测抗菌肽的抑菌效果。结果表明,AMP1及AMP2的抑菌作用较好,相对分子量分别为3 349.205 Da及1 373.820 Da。AMP1的MIC值分别为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)16μg/ml、金黄色葡萄球菌8μg/ml、枯草芽孢杆菌64μg/ml、肠炎耶尔森氏菌16μg/ml、肺炎克雷伯菌64μg/ml、大肠杆菌8μg/ml;AMP2的MIC值分别为金黄色葡萄球菌32μg/ml、枯草芽孢杆菌128μg/ml、肠炎耶尔森氏菌32μg/ml、大肠杆菌16μg/ml。试验结果表明,分离得到的抗菌肽具有广谱抗菌性,具有一定的开发潜力。

朊蛋白(prp105-125缺失)酵母双杂交诱饵载体的构建和鉴定

对小鼠朊蛋白(prp105-125缺失)的基因片段进行扩增,并将扩增片段导入诱饵载体pSos中构建酵母双杂交诱饵载体pSos-prp朊蛋白(prp105-125缺失),用重组质粒转化感受态酵母菌cdc25H,检验其表达产物在酵母细胞中有无毒性及自激活作用。序列分析结果表明,该试验成功构建了小鼠朊蛋白(prp105-125缺失)酵母双杂交诱饵载体,且该诱饵质粒的表达产物对酵母菌cdc25H既无毒性也无自激活作用。

鼠PrP的无细胞表达及其多克隆抗体的制备

目的成功的表达鼠的PrP,制备特异性的兔抗PrP多克隆抗体。方法以BALB/c小鼠肝脏基因组DNA作为模板运用PCR技术成功扩增了PrP23-231,将其克隆到pRSET原核表达载体中,构建重组表达载体pRSET PrP23-231。将该重组载体进行无细胞表达,然后对成功表达的PrP进行纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,并进行Western-blot鉴定。结果通过Western-blot鉴定,有约30kD的目的条带,证明蛋白成功表达,并进行其多克隆抗体的制备并进行Western-blot鉴定,有约30kD的目的条带,证明成功制备了PrP的多克隆抗体。结论成功表达了PrP23-231,并且成功制备了其多克隆抗体,为进一步研究PrP的功能奠定了基础。

酵母双杂交系统研究及其应用进展

分子生物学技术的发展和人类基因组计划的完成,使人类对基因的结构和功能的认识日益加深。基因工程领域又迎来了一个新的时代——功能基因组时代,它的任务就是解释大量生物体基因组测序结果,尤其是大量未经描述之基因的功能及其相应的蛋白质产物及功能。系统综合分析蛋白-蛋白相互作用将为了解蛋白质的功能提供重要的信息。酵母双杂交是目前研究蛋白-蛋白相互作用的所有方法中较为简便、灵敏和高效的一种方法。酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中研究蛋白质间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法。是一种新的直接于细胞内检测蛋白-蛋白相互作用,并且灵敏度很高的遗传学新方法,并被推广到了诸如细胞周期调控、信号传导、肿瘤基因表达等多个研究领域。

生物安全实验室生物反应器取样装置风险识别与控制

目的:解决生物安全实验室生物反应器在批量培养细胞接种病毒后取样过程中存在的安全隐患问题。方法:结合所购实验装置的特点,设计并制作取样口连接器及蒸汽消毒过程中产生的液体、气体收集装置。结果:优化和改进了取样方法。结论:最大限度降低和规避了取样操作过程中的风险,以达到安全操作的目的。

朊蛋白与金属离子之间作用的研究进展

朊病毒(PrPSc)是由动物体内正常朊蛋白PrPc构象改变形成的,PrPSc与PrPC在氨基酸序列上完全一致,PrPC中α-螺旋丰富而PrPSc富含β-折叠。目前,科学家还未研究清楚PrP的生理机能。人们普遍认为:人和动物感染朊病毒病时除PrP外还存在一些重要的辅助因子影响着PrPC变构、PrPSc传播、PrPSc引起神经细胞凋亡等病变过程,因此,研究朊蛋白的各种辅助因子将有助于阐明这方面的问题,这些辅助因子包括各种金属离子,如Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+。作者概述金属离子对朊蛋白结构和功能的影响,以及它们在朊病毒病的发病过程中可能起的作用。

蛙皮抗菌肽的提取及抗肿瘤活性检测

抗菌肽是一类防御性生物活性物质,广泛存在于细菌、植物、昆虫及动物中,具有抗菌、抗病毒及抗原虫作用。此外,抗菌肽还具有较强的抗肿瘤活性。抗菌肽的抗肿瘤机制特殊,可以选择性地作用于肿瘤细胞,通过破坏细胞膜、细胞骨架、细胞器等达到杀伤肿瘤细胞的目的,具有对动物正常细胞毒性较低,作用迅速,不易产生耐药性的特点[1]。

MALDI-TOF质谱技术及Biotyper数据库在养殖场空气微生物鉴定中的应用

以16SrRNA测序法为标准方法,利用MALDI-TOF质谱技术及Biotyper数据库对某猪场210株空气分离株进行鉴定及准确率分析。结果显示91.0%的菌株被准确鉴定到种水平,95.7%被准确鉴定到属水平。研究表明MALDI-TOF质谱技术可以快速准确检测空气微生物,为养殖场环境质量监测提供了新的技术支持。

动物组织中3种β-肾上腺受体激动剂残留的高效液相色谱荧光检测法

目的盐酸多巴胺、硫酸沙丁胺醇和盐酸莱克多巴胺是β-肾上腺素受体激动剂,该研究目的是建立一种用于这3种成分的检测方法,以防止人类食用含有该残留成分的畜产品引发食物中毒。方法实验选用SHIMADZU ODS C18反相色谱柱（150 mm×4.6 mm,5μm）,以含10%乙腈的0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（p H=2.50）为流动相A、含50%乙腈的0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（p H=2.50）为流动相B,在0~6 min内由A液变为B液进行梯度洗脱。激发波长（λex）为280 nm,发射波长（λem）为309 nm,对3种β-肾上腺素受体激动剂进行分离和检测。结果盐酸多巴胺、硫酸沙丁胺醇和盐酸莱克多巴胺分别在5~200、5~200和10~200 ng范围内呈良好的线性关系,其相关系数R2分别为0.999 3、0.999 9和0.999 2,其标准回收率分别为（101.50±3.42）%、（99.46±2.93）%和（101.83±4.12）%,变异系数为3.37%、2.95%和4.05%。样品的回收率分别为（60.74±1.05）%、（96.30±0.62）%和（91.02±1.28）%,变异系数分别为1.72%、0.64%和1.40%。盐酸多巴胺、硫酸沙丁胺醇和盐酸莱克多巴胺的最低检测限分别为0.1、0.125和5 ng。结论该方法简单,快速,准确,可用于实验室动物性食品中残留药物的常规检测。

野鸟粪便中细菌种类及耐药性分析

近年来,野鸟因涉及公共卫生而日益受到人们的高度关注。野鸟能贮藏、携带多种人兽共患病病原体,并通过粪便排泄、栖息环境或者与家禽的接触混群而散播病原。目前的流行病学调查研究大多集中在病毒性疾病,如禽流感、新城疫、莱姆病等多种传染病上,并已证实野鸟与这些疾病的传播和发生存在密切关系[1]。

PrP(D178N)无细胞表达、抗原性及结构分析

目的无细胞表达人178位点突变朊蛋白PrP(D178N),并分析其抗原性及结构。方法提取人血液基因组DNA,应用PCR法突变人PrP 178号位点。以正常的PrP为对照组,分别连接至真核表达载体pcDNA3.1上,利用无细胞真核表达系统进行表达。Western blot分析表达的重组蛋白的抗原性,电镜观察抗原结构。结果突变基因重组表达质粒构建正确;表达的PrP(D178N)蛋白相对分子质量约为28 000,对PK酶具有抗性,电镜下可见氧病相关纤维(Scrapie associated fibrils,SAF)存在。结论 已成功无细胞表达了PrP(D178N),为后续其突变后空间构象及致病机理的研究奠定了基础。

不同裂解工艺制备的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的透射电子显微镜观察

目的透射电子显微镜观察不同工艺制备的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗形态，筛选最佳裂解工艺，为疫苗的大规模生产提供参考依据。方法应用透射电镜对4种不同裂解工艺制备的甲型H1N1流感病毒疫苗进行形态观察，采用中和试验分析其免疫原性，异常毒性试验分析其安全性。结果透射电镜观察显示4种样品均无完整病毒，样品1裂解程度最大，囊膜破裂，多数为病毒碎片；样品2大多数囊膜未破损，缺少纤突；样品3较完整的病毒颗粒略小（约30-40nm），纤突清晰；样品4大多数病毒颗粒保留着纤突，但纤突已不整齐清晰。样品2组小鼠中和抗体滴度最低，而样品1、3、4组较高，与样品2组相比，差异明显，其中以样品3组最高；样品2组小鼠、豚鼠体重增加不明显，而样品1、3、4组小鼠、豚鼠体重增加明显，与样品2组相比差异显著，其中以样品3组最明显。结论电镜观察可直观反映疫苗裂解程度；3种裂解工艺均可用于疫苗生产，其中样品3具有较好的免疫原性和安全性，其工艺可作为最佳裂解工艺用于后续疫苗生产。

高等级生物安全实验室生物反应器加样过程风险识别与控制

目的:对生物反应器在高等级生物安全实验室加样操作过程中的风险加以识别,并通过设备的改进加以防范控制。方法:研究设计了生物反应器用加样口针头封闭器,并通过激光粒子计数器进行检漏。结果果:制作了生物反应器用加样口针头封闭器,通过激光粒子计数器对加样口周围环境进行检测,与环境本底比较未见气溶胶粒子检出。结论:在高等级生物安全实验室采用本研究设计的生物反应器用加样口针头封闭器既能简便操作,又能有效防止此环节中病原微生物的泄漏,从而保证了操作人员及实验室内环境的生物安全。

中国林蛙皮肤抗菌肽的分离、纯化及序列分析

两栖类动物的生活环境温暖潮湿，且含有复杂的微生物，由于其皮肤湿润、裸露，比较适合微生物生长，因此两栖类动物的皮肤成为微生物生存的极好环境。赖仞等研究表明，两栖类动物皮肤的分泌液中含有大量的抵御天敌、灭杀微生物的生物胺和活性多肽，含量要比其在哺乳动物体内的含量高，

黑斑蛙皮肤抗菌肽的纯化及抑菌活性研究

为了从黑斑蛙皮肤中获得纯度高且抑菌活性较强的抗菌肽(AMPs),试验采用稳压电刺激的方法提取黑斑蛙皮肤分泌物的粗提物。结果表明:黑斑蛙皮肤分泌物的粗提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌活性。利用高效液相色谱法对其进行纯化,通过纯化获得了一种纯度高且抑菌活性较强的AMPs,经过质谱鉴定,这种AMPs的相对分子质量为2 878.102。

犬瘟热病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用

为了建立一种新型、稳定、可普遍应用的诊断犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)的方法,试验采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合的方法,根据CDV N基因序列中同源性相对较高的保守区设计一套标有生物素(biotin)的特异性引物,结合异硫氰酸(FITC)荧光素标记的扩增产物,建立RT-LAMPLFD检测方法,对该方法的反应条件和反应体系进行优化,同时分析敏感性及特异性,最后检测临床应用情况。结果表明:试验成功构建CDV RT-LAMP-LFD方法,此方法的最佳反应条件为60℃反应60 min;最佳的反应体系为镁离子浓度12 mmol/L,甜菜碱浓度0. 2 mmol/L,Bst DNA聚合酶活性8 U,AMV酶活性5 U,外引物与环引物比例1∶2;最低检测下限为1×10~2个拷贝/m L,能够特异地检测出CDV的存在,犬细小病毒(CPV)等其他病毒均为阴性,可以检测出病犬口鼻腔黏液中的CDV。说明试验建立的CDV RT-LAMP-LFD检测方法特异性强,敏感性高,操作简单,可广泛应用。

犬瘟热病毒(CDV) RPA-SYBR Green Ⅰ 检测方法的建立与应用

为建立一种新型、稳定、可普遍应用的诊断犬瘟热病毒(CDV)的方法,将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)与SYBR GreenⅠ相结合,根据CDV N基因序列中同源性相对较高的保守区设计1套标有生物素Biotin的特异性引物和1条标记dSpacer、C3 Spacer的特异性探针,优化反应条件和体系,分析其灵敏性及特异性,最后建立一种可以进行临床应用的,特异性检测CDV的RPA-SYBR GreenⅠ方法。结果显示,成功构建检测CDV的RPA-SYBR GreenⅠ方法,此方法的最佳反应条件为实验人员闭合手掌中孵育10 min,引物与探针的最佳比例为2∶1。该方法的最低检测下限为1×10^(1)~1×10^(0) TCID_(50)/mL,能够特异地检测出CDV。应用本方法检测临床样品的结果与ELISA、RT-PCR方法的结果一致。结果表明,本试验所建立的CDV RPA-SYBR GreenⅠ检测方法特异性强,灵敏度高,操作简单,可应用于临床。

野生黑斑蛙皮肤抗菌肽快速分离、纯化方法的建立

抗菌肽（AMPs）也被称为抗微生物肽,是分子质量比较小,可以抗细菌、病毒及原虫等微生物的一类小肽[1-3],其来源广泛,且具有耐热、耐酸碱及对微生物重复使用不产生耐药性等特点[4-5]。由于其特殊的性质和生物学活性,已成为新型抗菌药物的研究热点。将抗菌肽从成分复杂的样品中分离出来是困扰此类药物研究的关键问题之一。

布鲁氏菌RPA-LFD快速检测方法的建立与应用

为建立一种新型、稳定、可普遍应用的诊断布病的方法,将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与胶体金侧向流试纸条技术(lateral flow dipstick,LFD)相结合。根据布鲁氏菌bcsp31基因序列保守区设计1套标有生物素Biotin的特异性引物和1条标记dSpacer、C3 Spacer的特异性探针,通过对反应条件、体系的优化,以及对敏感性、特异性以及模拟样本的分析,最后进行临床应用,建立一种可以检测布鲁氏菌的RPA-LFD方法。结果显示,成功建立了布鲁氏菌RPA-LFD检测方法,最佳反应条件为闭合手掌中孵育12 min;引物与探针的最佳比为3.5∶1;RPA-LFD方法的最低检测限为5.89 CFU/m L,能够特异地检测出布鲁氏菌,检测大肠杆菌等其他细菌结果均为阴性;用RPA-LFD方法检测模拟样本和临床样品的结果与ELISA方法一致。上述结果表明,本研究建立的布鲁氏菌RPA-LFD检测方法特异性强、灵敏性高、操作简单,可广泛应用于临床检测。

布鲁氏菌LPS单克隆抗体修饰的纳米颗粒制备及电镜观察

为了研究新型纳米材料在免疫电镜技术及病原超微结构观察、定位等方面的应用,试验用羧基量子点微球、时间分辨荧光微球、胶体金颗粒3种纳米材料对布鲁氏菌LPS单克隆抗体进行标记,再与布鲁氏菌病试管凝集试验抗原结合成抗原-抗体免疫复合物,并用电镜观察标记结合效果。结果表明:在电镜下,可观察到布鲁氏菌病试管凝集试验抗原以聚集或单个菌体形式存在。羧基量子点微球、时间分辨荧光微球均以几个或多个颗粒聚集形式存在,其大小、形貌在标记前后并无显著差异;胶体金颗粒则较为均匀地分散在视野中,标记后的胶体金颗粒周围可见抗体晕;标记抗体的微球可与布鲁氏菌病试管凝集试验抗原特异性结合,视野背景干净,菌体呈球杆状,菌体周围吸附了多个纳米颗粒。说明新型纳米材料可用于病原体的免疫电镜技术及微观形态观察、定位等研究。