耐除草剂棉花GGK2的遗传稳定性分析及性状鉴定

【目的】明确转基因耐除草剂棉花GGK2的遗传稳定性和营养品质等性状,为其产业化应用提供数据基础和技术支撑。【方法】针对实验室培育的新型耐除草剂棉花GGK2,选取其T3、T4、T5代开展试验研究。利用特异性PCR和Southern blot开展基因组整合稳定性分析;利用实时荧光定量PCR、ELISA和胶体金试纸条开展表达稳定性分析;通过田间喷施草甘膦测试其除草剂耐受稳定性,以及依据相关国际或国内行业标准进行棉籽营养成分分析等。【结果】抗除草剂基因GR79 EPSPS和GAT,以及筛选标记基因NPTⅡ以单拷贝形式整合到棉花GGK2基因组D10染色体,且能够在T3、T4、T5代转基因棉花中稳定遗传,同时发现基因组中不含有遗传转化载体的骨架片段。表达分析发现GR79 EPSPS、GAT和NPTⅡ3个基因在棉花GGK2的不同时期、不同组织部位均有表达,其中,叶片中的表达量相对较高。四叶期、盛花期、吐絮期3个蛋白在叶片中表达量分别介于128.7—192.4μg·g^(-1)、24.4—35.0μg·g^(-1)和17.0—23.9μg·g^(-1)鲜重,利用GR79 EPSPS单克隆抗体制备的胶体金试纸条可以对田间棉花GGK2叶片实现快速鉴定。除草剂耐受性分析结果显示,转基因棉花GGK2可耐受4倍生产使用剂量的草甘膦除草剂。T3—T5不同世代棉花喷施除草剂后均未发现受害症状,而且整个生育期的生长发育未受影响。棉籽营养成分分析表明,来源于新疆、河北和河南种植的GGK2棉籽中,水分、灰分、蛋白质、脂肪、粗纤维、维生素及脂肪酸含量与非转基因对照之间无显著差异,各指标的含量水平均位于ILSI数据库报道的范围内。【结论】转基因棉花新种质GGK2的耐除草剂性状遗传稳定性好、除草剂耐受能力强、籽粒营养成分与非转基因对照之间无显著差异,在耐除草剂棉花生物育种具有重要的应用价值且产业化前景好。

中国转基因棉花研发应用二十年

转基因技术是指利用重组DNA原理,将优良目的基因整合到靶标生物基因组中,并使靶标生物得以表达目的性状的技术。这一技术克服了生物有性杂交的限制,使物种间基因交流的范围无限扩大,既可以从原核生物到真核生物,也可以从单细胞生物到多细胞生物,还可以从低等生物到高等生物,反之亦然。因此,这项技术自发明以来,即广泛应用于农业、林业、医学等领域,为其研究开辟了一个全新的时代。转基因植物是以农杆菌等为媒介,将来源于动物、植物或微生物等其他生物甚至人工合成的外源基因转入基因组中,使之稳定遗传并赋予其靶标性状,如抗病、抗虫、抗逆、高产、优质等的植物。以1972年构建第一个重组DNA分子为契机,1983年首次获得转基因烟草为起点,植物转基因技术在近30年的时间内发展迅猛,至今已有200多种植物已成功获得转基因株系,40多种数千例转基因植株进入田间试验。根据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计,全球转基因植物的种植面积由1996年的260万hm2已经迅速增到2014年的1.815亿hm2,累计种植面积大约比中国国土总面积还多80%。在全球转基因植物研发和应用迅猛发展的同时,中国也先后批准了7种转基因植物的生产应用,其中,抗虫棉是唯一大规模应用的转基因农作物。从1994年中国研制成功国产单价抗虫棉(GK),以及1995年美国保铃棉进入中国至今,抗虫棉已经在中国推广应用了近20年的时间。文章介绍了这20多年来,中国科学家在抗虫、抗旱耐盐碱、抗除草剂、抗病以及纤维品质改良等性状方面所取得的转基因棉花研究进展;在农杆菌介导、基因枪轰击、花粉管通道介导、茎尖或芽尖转化、农杆菌液浸染和纳米载体花粉介导等不同转化技术上所进行的探索;同时,介绍了中国转基因植物的安全性评价状况,并从抗虫棉品种审定、发展趋势和产业化状况几个方面,介绍了转基因抗虫棉在中国的应用,最后对未来转基因棉花研究方向进行展望。

苏云金杆菌δ-内毒素基因及3′末端缺失基因在大肠杆菌和农杆菌中的亚克隆和表达

苏云金芽孢杆菌变种Bacillus thuringiensis aizawai 7-29 δ-内毒素基因及其3′末端缺失基因,亚克隆到质粒pUC19上,构建了pUCF33和pUCK63重组质粒。进一步将δ-内毒素基因及其3′端缺失基因,插入到植物表达载体pBI121.2质粒中,构建了pGY61和pGYCK63重组质粒。用^(32)中标记的δ-内毒素3′末端缺失的Kpn I DNA片段的探针,与重组质粒进行DNA-DNA分子杂交,结果阳性。带有全长和3′末端缺失重组质粒,转入大肠杆菌HB101和农杆菌LA4404受体细胞中,其克隆子细胞抽提物,对大菜粉蝶和玉米螟幼虫均具有杀虫生物活性。结果证明δ-内毒素基因不仅能在大肠杆菌HB101中,而且能在农杆菌LA4404中表达。

中国抗虫棉GFM CrylA杀虫基因的合成及表达载体构建

根据苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CrylA(b)和CrylA(c)的氨基酸序列,采用植物偏爱密码子,人工合成了全长1824bp的融合GFM CrylA Bt杀虫基因,并构建了带有多个表达调控元件的该基因高效植物表达载体pGBI1214AB,以及该基因和修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因的双价杀虫基因植物表达载体pGBI1214ABC.经在烟草中验证,这两种表达载体在植物中可高效表达并赋予转基因烟草抗虫性.为我国抗虫棉的研究打下了基础.

三系棉遗传基础研究及育种进展

1研究背景 棉花具有明显的杂种优势，优良的杂种F1能比常规品种增产15％以上，同时可以改善品质，增强抗逆性，因而发展抗虫杂交棉对于实现棉花高产、稳产、高效，使棉花生产再上新台阶具有重大意义。目前，棉花杂交制种的方法主要包括三种：人工去雄授粉法、利用核不育系制种的“两系法”和利用质核互作不育系制种的“三系法”。

降解食品中胆固醇的芽孢杆菌T12-1的筛选与应用研究

以胆固醇为惟一碳源和能源 ,从食肉动物肠道的 19份样品中筛选出有胆固醇降解酶活性的菌株 4 0株 ;通过比较 ,选出了在培养液中生长速度较快和产酸能力较强的 4株菌 ,进而选出胆固醇降解活性较高的菌株 T12 - 1;菌株 T12 - 1发酵上清液应用在蛋黄胆固醇降解中 ,作用显著 ;经动物试验 ,T12 - 1菌株在食品中应用安全、无毒。

SDS-CTAB结合法提取棉花总DNA

根据以往提取棉花总DNA的经验 ,并参考了几种相关的植物总DNA提取方法 ,得到一种更适合棉花 (GossypiumL .)总DNA提取的方法。该提取方法综合了SDS法与CTAB法的优点 ,使获得的棉花总DNA纯度高 ,得率大 ,完整性较好 ,可用于PCR检测 ,Southern杂交 ,RAPD ,染色体步移等分子生物学操作。

双价基因(Bt+CpTI)抗虫棉对棉铃虫的杀虫活性及抑制生长作用

比较了转 Bt+ Cp TI双价基因抗虫棉 (双价棉 )与转 Bt单基因棉 ( Bt棉 )对棉铃虫不同Cry1 Ac抗性种群杀虫活性的时间动态和对不同龄期幼虫的抑制生长作用。结果表明 ,双价棉叶对棉铃虫的杀虫活性于 6月底最高 ,7月底和 8月下旬逐渐下降 ,高于同期测定的 Bt棉的杀虫活性。双价棉对棉铃虫抗性种群 2～ 5龄幼虫的死亡率、存活幼虫体重、化蛹率和成虫羽化率等生长发育的影响 ,均显著高于 Bt棉。用 Bt棉叶连续饲养不同龄期抗性棉铃虫 ,2龄幼虫就可部分化蛹和羽化 ,而用双价棉饲养 ,5龄以下幼虫不能化蛹和羽化 ,表明双价棉对抗性棉铃虫具有较强的抗虫性。

花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子在转基因棉花中的表达

利用GUS作为报告基因 ,通过GUS组织化学定位法检测棉花转化愈伤组织、体细胞胚 ,R0 代棉花根、茎、叶、花器官以及正在发育的胚GUS基因表达情况 ,详细阐述了CaMV 3 5S启动子在棉花细胞中的表达轮廓。结果表明 ,在愈伤组织细胞有丝分裂和增殖过程中GUS基因能稳定表达并遗传给后代细胞 ;在根、茎、叶细胞中检测到GUS表达活性。在胚胎发育过程中 ,最早检测到GUS表达活性的为开花 1 1d的鱼雷胚和胚乳。随着胚胎的发育 ,GUS表达活性逐渐增强并扩展到子叶微管组织 ,表明CaMV 3 5S启动子是随着胚胎发育进程被逐渐调节的。在花粉和特殊的纤维细胞中 ,也检测到GUS的表达活性。资料证明 ,该启动子在棉花不同发育时期的大部分组织和细胞中都是表达的。

转基因双价抗虫棉中Cry1Ac基因与CpTI基因的共表达

以转基因双价抗虫棉自交后代为材料,利用PCR、Southern杂交、ELISA检测方法,分析了Cry1Ac基因与CpTI基因在基因组中的整合情况,结果显示,除sGK321和3517外,其余品种Cry1Ac基因和CpTI基因的整合位点不同,并且sGK321中两基因也只有一个位点相同;ELISA结果表明,同一个品种同一部位Cry1A蛋白和CpTI蛋白不能完全同步表达,它们的表达量存在差别,且这种差别在整个生长阶段并不稳定。

国产转基因抗虫棉研究回顾与展望

棉花是我国最重要的经济作物之一,抗虫棉的研制成功与大规模产业化在保障我国植棉业的稳步发展、促进棉纺工业的快速增长、保护环境、增加农民收入和促进农业可持续发展方面作出了重要贡献。作者回顾了国产转基因抗虫棉从单价、双价到融合研究的重要历程,介绍了国产抗虫棉产业化的突出成绩,并对抗虫棉的深化研究、育种技术等作出展望。

不同转基因抗虫棉对棉铃虫抗虫性的时空动态

利用 2个对Bt抗性水平不同的棉铃虫品系 ,测定了转Bt和CpTI基因双价抗虫棉 (SGK32 1)和Bt棉 (GK12 ,33B)杀虫活性的时间和空间动态变化。结果表明 ,2类 3种抗虫棉杀虫活性共同表现为 :(1)时间动态上均呈现前高后低的下降趋势 ;(2 )空间动态上表现为 ,在生长前期以叶的活性最高 ,中后期以铃和蕾的活性较高 ;(3)对敏感品系的活性高于对抗性品系。不同点表现为 :(1)双价棉在生长中后期 (8～ 9月份 )活性明显高于Bt棉 ;(2 )双价棉对抗性品系的活性表现更稳定。

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因导入大豆的研究

用苏云金芽孢杆菌(BacillusthuringiensisBerliner)杀虫晶体蛋白(Bt)基因和葡糖苷酸酶(GUS)基因通过基因枪轰击和根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens(SmithetTownsend)Conn)介导转入大豆(Glycinemax(L.)Merr.),诱导大豆转基因植株再生。大豆主栽品种“中黄4号”和品系8502未成熟子叶有较强体细胞胚分化能力。体细胞胚的脱水处理显著促进“中黄4号”体细胞胚的萌发。未成熟子叶的预培养有利于根癌土壤杆菌感染子叶外植体体细胞胚的分化。基因型和受体的选择,转基因体系的改进,体细胞胚的脱水处理等是提高大豆转基因效率的重要因素。

转CryIA和CpTI双价抗虫基因大豆的获得与稳定表达

【目的】将抗虫基因转入栽培大豆中,提高大豆的抗食心虫能力。【方法】利用大豆未成熟子叶体细胞胚发生系统高效转化体系,将携带有人工合成的CryIA杀虫基因和CpTI基因的高效双价杀虫基因植物表达载体pGBI121S4ABC转化到大豆主栽品种吉林20与吉林27中。【结果】GUS活性分析、PCR、Southern blot检测证明,目的基因已整合到受体大豆基因组中。T1代转基因大豆抗虫测定表明,转基因材料虫食率比对照显著降低,抗虫能力显著提高。【结论】T3～T5连续3代接虫测定结果表明,转基因大豆株系0-195和0-150的虫食率均比对照低大约30%,其抗虫能力已基本稳定。

花粉管通道法介导的棉花遗传转化

花粉管通道法介导的遗传转化是一种借助于植物自身的种质细胞卵细胞或受精卵为转化对象的直接转化技术.作为一种颇具特色的转基因技术,由于具备无基因型限制和易于实现大规模基因转化的特点,可以在任何开花植物和不同物种之间实现基因的转移,使得受体物种在获得新的基国型的同时,也获得转基因所表达的新的表型性状,由此成为农作物转基因育种的崭新技术途径.利用花粉管通道法,成功地进行了棉花的抗虫/抗病的基因工程,获得了多种实用化的抗虫/抗病转基因棉花新品种(系),进入了棉花大面积生产.

转Bt杀虫蛋白基因的抗棉铃虫棉花新种质

采用花粉管通道途径,将合成的 Bt 杀虫蛋白基因导入棉花优良品种泗棉3号和中棉所12号,获得了转基因植株。组织化学分析表明,GUS 标记基因已在 R_1代植株中得到表达。据对 GUS 阳性转基因棉株的 PCR 分析结果,证明 Bt 杀虫蛋白基因出现在 R_1代中,并通过自交传递至 R_2代。经鉴定,获得了5株对棉铃虫幼虫有高度毒杀作用的 R_1代单株S545、S591、S636、S1001(泗棉3号+Bt/GUS)及 Zh1109(中棉所12号+Bt/GUS),棉铃虫幼虫致死率分别达到91.6%、93.8%、92.3%、85.7%、75.0%。并由 R_1代自交后形成 R_2代抗虫棉群体,表明获得了抗棉铃虫棉花新种质。

棉花腺苷酸核糖基化作用因子1(arf1)的结构特征、替换剪接和遗传表达分析

用已建立的新型染色体步移技术同尾酶反向PCR和快速分离目的基因cDNA 5′未知序列方法从陆地棉品种Y18中分离到腺苷酸核糖基化作用因子 1(arf1)的全长cDNA、DNA和启动子序列。结果表明 ,该基因全长 436 0bp ,具有 6个内含子和 7个外显子 ,在第一个内含子处存在替换剪接现象 ,使该基因在棉花中分别形成 10 2 6、110 3和 15 4 4bp的 3种mRNA。该基因编码 181个氨基酸 ,转录起始位点上游具有转录起始子、TATA盒、CAAT盒、GC盒、多个正向重复序列和反向重复序列 ,在转录起始位点下游具有富含AT序列和回文结构等启动子特征序列。Southern杂交结果表明 :该基因在棉花基因组中有两个拷贝。Northern杂交结果表明 :该基因在棉花的蕾、花。

透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究

为获得高效表达外源蛋白的Pichiapastoris菌株而设计了重组质粒pPIC9K_vgbbxn ,其中透明颤菌血红蛋白基因vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度 ,腈水解酶基因bxn分泌表达。转化GS115菌株后 ,通过PCR、SDS_PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达 ,以及用准确的蛋白活性测定方法成功地检测到二者所表达的产物均具有正常的活性。摇瓶发酵实验证明 。

利用转基因技术进行植物遗传改良

生物技术的发展为植物遗传改良开辟了一条新途径 ,论述了转基因技术在植物遗传改良中的应用及其与传统育种方法的关系。