屎肠球菌对仔猪肠道健康的影响

屎肠球菌是仔猪生产中常用的益生菌之一。该益生菌不仅能够在仔猪的胃肠道中存活,并维持仔猪肠道菌群平衡,还可以调节仔猪的小肠绒毛发育、养分吸收、免疫功能以及抗衣原体、轮状病毒和鼠伤寒沙门氏菌感染的能力,对仔猪肠道健康有重要影响。本文就上述研究进展进行综述。

热灭活屎肠球菌及其活菌对仔猪腹泻率、消化酶活性和脏器指数的影响

为了研究屎肠球菌对哺乳期仔猪的益生作用,试验选用健康的杜×长×大新生仔猪9窝,将其随机分为对照组、屎肠球菌灭活菌组和屎肠球菌活菌组,每组3窝。从出生开始至6日龄,对照组、屎肠球菌灭活菌组和屎肠球菌活菌组仔猪分别经口灌服无菌脱脂乳、含屎肠球菌热灭活菌（浓度为1×108cfu/m L）的脱脂乳和含屎肠球菌活菌（浓度为1×108cfu/m L）的脱脂乳,10 m L/（头·d）。仔猪于7日龄开始饲喂教槽料,21日龄断奶。分别于7日龄和21日龄时从每窝中选出1头接近平均体重的仔猪屠宰,取肝脏和脾脏,采集空肠黏膜,计算并分析仔猪腹泻率、消化酶活性和脏器指数。结果表明：与对照组相比,灭活菌和活菌都不影响哺乳期仔猪的体重和日增重（P〉0.05）;屎肠球菌灭活菌组和屎肠球菌活菌组仔猪第3周的腹泻率都下降至0,整个哺乳期腹泻率分别下降77.44%（P=0.078）和92.03%（P〈0.05）,两个益生菌组间差异不显著（P〉0.05）;屎肠球菌灭活菌组和屎肠球菌活菌组的21日龄仔猪空肠麦芽糖酶活性分别增加9.67倍（P〈0.05）和11.29倍（P=0.01）,活菌还显著提高脂肪酶含量1.09倍（P〈0.05）,但两个益生菌组间差异不显著（P〉0.05）;灭活菌不影响仔猪肝脏指数和脾脏指数,活菌也不影响肝脏指数及7日龄仔猪脾脏指数,但显著降低21日龄仔猪脾脏指数（P〈0.05）。说明热灭活益生屎肠球菌对哺乳期仔猪的生长、腹泻率、小肠消化酶活性以及肝脏和脾脏指数都没有负面影响,而且在很大程度上与活菌的作用相似,具有替代活菌的潜力。

屎肠球菌对哺乳期仔猪结肠微生物群落优势门属的影响

【目的】分析屎肠球菌(Enterococcus faecium)活菌对哺乳期仔猪结肠微生物群落优势门属的持续影响,为揭示益生菌调节仔猪肠道健康的作用机制及人为调控仔猪肠道微生物以促进其健康提供参考依据。【方法】给健康新生仔猪灌服无菌脱脂乳(对照组)或屎肠球菌制剂(益生菌组),持续灌服6 d,分别采集7和21日龄仔猪结肠内容物,提取总细菌DNA后进行PCR扩增,采用Illumina MiSeq高通量测序技术检测16S rRNA序列的V3～V4可变区,分析肠道微生物群落α多样性及其在门和属分类水平上的结构特点。【结果】给新生仔猪灌服屎肠球菌并不影响7和21日龄仔猪结肠微生物群落α多样性。与对照组相比,益生菌组7日龄仔猪结肠微生物群落优势门的相对丰度无显著变化(P>0.05,下同),21日龄仔猪拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度也无显著差异,但变形杆菌门(Proteobacteria)相对丰度呈显著增加趋势(P<0.05,下同);在属水平上,益生菌组7日龄仔猪结肠微生物群落中相对丰度变化明显的优势属均隶属于拟杆菌门,其中,普雷沃氏菌属(Prevotella)相对丰度显著增加,而拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度极显著减少(P<0.01,下同),丁酸单胞菌属(Butyricimonas)相对丰度显著减少;21日龄仔猪结肠微生物群落中66.67%优势属的相对丰度呈减少趋势,其中以厚壁菌门4个属的变化尤其明显,即巨型球菌属(Megasphaera)相对丰度极显著减少,乳杆菌属(Lactobacillus)、产琥珀酸菌属(Succiniclasticum)和粪杆菌属(Faecalibacterium)相对丰度显著减少。【结论】新生仔猪口服屎肠球菌能对其结肠微生物群落优势门或属组成产生持续影响,表现为促进有益于结肠健康菌属的生长,而抑制具有潜在致病性菌属的增殖,为今后定向研究调控仔猪肠道健康的肠道共生微生物提供明确范围。

屎肠球菌活菌和热灭活菌对RAW264.7细胞肿瘤坏死因子-α/白细胞介素-10平衡以及丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

本试验旨在通过体外试验研究益生菌屎肠球菌活菌和热灭活菌免疫调节作用的差异。试验分为2部分:1)研究屎肠球菌的类型、剂量和作用时间对RAW264.7细胞的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)/白细胞介素-10(IL-10)平衡的影响。试验共设12个组,每个组6个重复。采用3因素2水平设计试验方案。因素1及水平:屎肠球菌类型,活菌或热灭活菌;因素2及水平:剂量,106或108 CFU/mL;因素3及水平:作用时间,3或6 h。在3和6 h作用时间下分别设置阴性对照(DMEM细胞基础培养液)和阳性对照[脂多糖(LPS),2μg/mL]。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组细胞培养上清中TNF-α和IL-10含量,据此计算TNF-α/IL-10的比值。2)研究屎肠球菌活菌或热灭活菌对由LPS引起RAW264.7细胞的TNF-α/IL-10失衡的调节作用。试验共设8个组,每个组6个重复。对照组用DMEM细胞基础培养液处理细胞3 h,LPS组用LPS(2μg/mL)处理细胞3 h;LB-LPS或HB-LPS组先用屎肠球菌活菌或热灭活菌处理细胞3 h,再用LPS处理3 h;LPS-LB或LPS-HB组先用LPS处理细胞3 h,再用屎肠球菌活菌或热灭活菌处理3 h;LPS+LB或LPS+HB组用屎肠球菌活菌或热灭活菌与LPS同时共处理细胞3 h。采用ELISA法检测各组细胞培养上清中TNF-α和IL-10含量,然后计算TNF-α/IL-10的比值,用Western blot法检测磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、磷酸化p38(p-p38)以及磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的蛋白相对表达量。结果表明:1)屎肠球菌类型、剂量、作用时间中的1个或多个因素极显著影响TNF-α或IL-10含量(P<0.01),或者TNF-α/IL-10比值(P<0.01),3个因素的两两或三者之间的交互效应因细胞因子而异。屎肠球菌热灭活菌对TNF-α分泌的诱导作用极显著弱于活菌(P<0.01),对IL-10含量的影响与活菌相似(P>0.05),对TNF-α/IL-10比值的影响小于活菌(P<0.05或P<0.01),且低剂量(106 CFU/mL)热灭活菌在作用时间较短(3 h)时能维持TNF-α/IL-10平衡。2)屎肠球菌活菌和热灭活菌分别通过促进IL-10分泌(P<0.01)和抑制TNF-α释放(P<0.01)来抵抗LPS对TNF-α/IL-10平衡的破坏作用,经热灭活菌预处理的细胞能够保持TNF-α/IL-10平衡不受LPS干扰。此外,屎肠球菌活菌和热灭活菌预处理细胞对LPS活化细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路没有产生显著影响(P>0.05),但热灭活菌预处理细胞极显著促进了LPS活化p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路(P<0.01)。综上可知,屎肠球菌的类型和剂量是影响TNF-α/IL-10平衡的主要因素,而且屎肠球菌的类型与剂量、剂量与作用时间之间都有交互效应,低剂量热灭活菌且作用时间短才有利于维持TNF-α/IL-10平衡。活菌与热灭活菌以不同方式减轻LPS引起的TNF-α/IL-10失衡,但它们对MAPK信号通路的确切影响还有待进一步研究确定。

屎肠球菌对仔猪小肠紧密连接蛋白、细胞因子应答以及Toll样受体基因表达的影响

本研究旨在比较屎肠球菌活菌和灭活菌对仔猪小肠紧密连接蛋白、细胞因子应答以及Toll样受体(TLR)基因表达的影响。试验选用健康的杜×长×大新生仔猪9窝,窝产仔数10-11头,随机分为对照组(CON组)、屎肠球菌活菌组(LB组)和屎肠球菌灭活菌组(HB组),每组3窝仔猪。从出生开始至6日龄,CON组、LB组和HB组仔猪分别经口灌服无菌脱脂乳、含屎肠球菌活菌(1×10^(8) CFU/mL)的脱脂乳和含屎肠球菌灭活菌(1×10^(8) CFU/mL)的脱脂乳,口服剂量为10 mL/(头•d)。仔猪于7日龄开始饲喂教槽料,21日龄断奶,并分别于这2个日龄从每窝中选出1头接近平均体重的仔猪屠宰取样,检测小肠黏膜紧密连接蛋白和细胞因子应答基因表达及分泌量,以及Toll样受体基因的表达。结果表明:1)与CON组相比,LB组7日龄仔猪空肠黏膜闭锁小带蛋白-1(ZO-1)基因相对表达量有提高趋势(P=0.08),而回肠黏膜ZO-1基因相对表达量则显著提高(P<0.05);LB组和HB组21日龄仔猪空肠和回肠黏膜ZO-1基因相对表达量均无显著变化(P>0.05)。2)与CON组相比,仔猪7日龄时,LB组空肠黏膜白细胞介素-8(IL-8)基因相对表达量有降低趋势(P=0.052),白细胞介素-10(IL-10)基因相对表达量呈提高趋势(P=0.063),但肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β(TGF-β)基因相对表达量均无显著变化(P>0.05);HB组空肠黏膜IL-8基因相对表达量显著降低(P<0.05),但其他细胞因子基因相对表达量均无显著变化(P>0.05);LB组和HB组回肠黏膜IL-8、IL-10、TNF-α和TGF-β基因相对表达量均无显著变化(P>0.05)。与CON组相比,仔猪21日龄时,LB组空肠黏膜IL-8基因相对表达量显著降低(P<0.05),回肠黏膜IL-8基因相对表达量也显著降低(P<0.05),且IL-10和TGF-β基因相对表达量显著提高(P<0.05);HB组空肠黏膜IL-8基因相对表达量显著降低(P<0.05),TGF-β基因相对表达量显著提高(P<0.05),但回肠黏膜的4种细胞因子基因相对表达量无显著差异(P>0.05)。3)与CON组相比,LB组7日龄仔猪空肠黏膜TNF-α分泌量有降低趋势(P=0.087),而回肠黏膜IL-10分泌量则显著提高(P<0.05),且21日龄仔猪空肠黏膜IL-8分泌量显著减少(P<0.05),对TGF-β的分泌量无显著影响(P>0.05);HB组7日龄仔猪空肠和回肠黏膜细胞因子分泌量均无显著变化(P>0.05)。4)与CON组相比,LB组和HB组7日龄仔猪空肠和回肠黏膜TLR-2、TLR-4、TLR-9基因相对表达量均无显著变化(P>0.05);LB组和HB组21日龄仔猪空肠黏膜TLR-2、TLR-4、TLR-9基因相对表达量也无显著变化(P>0.05),但HB组回肠黏膜TLR-4基因相对表达量显著提高(P<0.05)。综上所述,屎肠球菌活菌比灭活菌更有利于增强小肠黏膜紧密连接蛋白基因表达,调节细胞因子基因表达和分泌,并稳定小肠黏膜TLR基因表达,从而改善仔猪肠道健康。