无菌金黄地鼠模型建立

目的使用剖宫产净化(cesarean section purification)方法建立无菌金黄地鼠模型。方法供胎母鼠选择SPF级金黄地鼠,雌雄按1∶1进行交配,见栓后与雄鼠分开饲养。代乳母鼠的合笼时间应早于供胎母鼠一周。怀孕的金黄地鼠临产时在超净工作台内进行子宫摘除术,传入净化用隔离包内,剥离子宫获得待净化乳鼠,分别使用无菌级ICR小鼠和无菌级SD大鼠进行代乳,成功离乳后转入饲养用隔离包内。每月对饲养用隔离包进行无菌状态检测。结果共实施3次剖宫产手术,第1次和第2次代乳失败,第3次代乳成功,获得仔鼠18只,存活率88%,离乳存活率66%,依照GB/T 14926.41-2001进行无菌金黄地鼠状态检测均为合格。结论通过剖宫产净化技术,使用无菌级ICR小鼠和无菌级SD大鼠进行代乳,达到微生物净化目的,获得无菌化金黄地鼠模型。

博物馆数据库建设标准化尝试——以中国人民抗日战争纪念馆图片、音视频数据库为例

博物馆数据库建设在我国已有一定的积累,并有提高标准水平的现实需求。建设数据库所需要的元数据规范,国内外许多成果可资借鉴。建立包含有形无形文化遗产的全资源博物馆数据库是数字博物馆、智慧博物馆的基础,建立一套数据库元数据编目规则则是博物馆数据库建设的基础。中国人民抗日战争纪念馆图片、音视频数据库管理系统的框架结构、功能作用及其背后的元数据著录规范,可为博物馆数据库建设提供实践经验。

金黄地鼠生物净化及其应用

金黄地鼠被用于研究人类相关疾病已有60多年,广泛应用于新型冠状病毒、代谢性疾病发病机制、疫苗和治疗性药物效果评价的研究中。WTO规定用于疫苗生产和检定的金黄地鼠必须达到无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级,而目前国内使用的多为普通级。通过生物净化提升金黄地鼠种群微生物等级势在必行。本文概述了金黄地鼠在新型冠状病毒、代谢性疾病研究中的应用及相关生物净化技术工作进展。

不同灭菌方法对猪专用配方奶粉营养成分的影响

目的使用不同灭菌方式对猪专用配方奶粉进行灭菌,探讨对配方奶粉营养成分损失最小的灭菌方法及灭菌条件。方法猪专用配方奶粉分为高压灭菌组和辐照灭菌组。高压灭菌组按照不同灭菌条件、辐照灭菌组按照不同60Co-γ射线剂量对配方奶粉进行灭菌。按国家标准对灭菌处理后的配方奶粉进行无菌状态检测和营养成分含量测定。结果经不同灭菌方法处理后各组配方奶粉无菌状态检测结果均为阴性。常规营养成分在高压灭菌组121℃30 min、辐照灭菌液体组50 kGy灭菌条件下粗蛋白含量降低有极显著性差异(P<0.01)、辐照灭菌粉末组50 kGy水分、粗蛋白和钙含量降低有极其显著性差异(P<0.001)。缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸在辐照灭菌粉末组50 kGy灭菌条件下含量变化无显著性差异,高压灭菌组和辐照灭菌液体组所有氨基酸含量均降低(P<0.001)。微量元素在高压灭菌组121℃30 min灭菌条件下铁含量增加(P<0.001),在辐照灭菌液体组25 kGy灭菌条件下铁和钾含量增加(P<0.001)、镁含量增加(P<0.01)。在辐照灭菌粉末组50 kGy灭菌条件下镁含量增加具有显著性差异(P<0.05),钠含量增加(P<0.01)。维生素在高压灭菌组121℃30 min灭菌条件下VE、VB_(2)含量增加(P<0.001)。在辐照灭菌液体组50 kGy灭菌条件下VE含量增加(P<0.05),VB_(2)含量减少(P<0.001)。在辐照灭菌粉末组25 kGy灭菌条件下VE、VA含量减少(P<0.001)。结论高压灭菌组121℃30 min营养成分损失最小;辐照灭菌组50 kGy辐照剂量营养成分损失最小。两种灭菌方法比较,50 kGy辐照灭菌粉末组营养成分含量损失最少。

卢帕他定联合转移因子口服液治疗慢性荨麻疹的临床观察

目的探讨卢帕他定片联合口服因子治疗慢性荨麻疹(chronic spontaneous urticaria,CSU)的临床疗效、不良反应及安全性。方法收集本市2018年3月至2019年3月间皮肤科门诊就诊的70例慢性荨麻疹患者,按照随机数字表法分为两组,各35例,对照组接受常规剂量的卢帕他定片治疗,观察组接受卢帕他定片联合转移因子口服液治疗。两组患者均持续治疗6 w,采用ELISA检测方法检测两组患者血清中IL-33和IL-35的表达情况,通过瘙痒程度、风团数量、风团直径、瘙痒持续时间4项指标的评分总和对CSU疾病程度进行评价,根据症状积分下降指数(symptom score reduce index,SSRI)评价治愈例数。结果对照组和观察组患者血清的IL-33含量均有下降,差异显著(P<0.05),并且观察组与对照组相比,IL-33水平进一步下降,差异有统计学意义(P<0.05);两组患者血清中IL-35含量均较治疗前有所提高,差异有统计学意义(P<0.05),并且观察组与对照组相比,IL-35水平进一步提高,差异有统计学意义(P<0.05);对照组和观察组的症状积分均有所下降,差异有统计学意义(P<0.05),且观察组的症状积分较对照组进一步下降,差异统计学意义(P<0.05);对照组治疗后有效率74.29%,观察组治疗后有效率91.43%,两组有效率比较,差异有统计学意义(P<0.05);观察组和对照组发生不良反应的例数分别为3例和5例,不良反应的发生率分别为8.57%和14.29%,观察组和对照组患者的不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。结论卢帕他定联合转移因子能够有效改善IL-33、IL-35的表达水平,降低CSU患者的症状积分,提高治愈有效率,且不良反应少,具有较好的临床应用价值。

建立阿尔茨海默症人源肠道菌群动物模型

目的使用粪菌移植方法经口途径获得阿尔茨海默症人源肠道菌群(human flora-associated,HFA模型小鼠,并通过生物信息学、组织病理学等方法对模型进行评价。方法无菌雌性C57BL/6J小鼠28只,随机分为阿尔茨海默症模型(AD)组和对照(CON)组,分别经口途径接种阿尔茨海默症患者及健康志愿者的新鲜粪便悬液,在移植6、10周后每组安乐7只动物,取粪便进行16S r DNA检测;取脑组织和血液进行Aβ含量、细胞因子检测,脑组织进行组织病理学检查。结果CON组与AD组动物体重增长差异无显著性。α-多样性分析,在造模后两个时间点AD组Simpson指数升高(P<0.05,P<0.01),ACE(P<0.05)和Chao1(P<0.05),Shannon指数降低(P<0.05,P<0.01),与CON组比较差异有显著性。在科水平,AD组拟杆菌科丰度升高(P<0.01,P<0.05),毛螺菌科(P<0.001)、消化链球菌科(P<0.01)丰度降低;在属水平,AD组拟杆菌属丰度升高(P<0.01,P<0.05),梭菌属(P<0.01,P<0.05)、毛螺菌属(P<0.01,P<0.0001)、寄生菌属(P<0.01,P<0.001)丰度降低,与CON比较差异有显著性。β-多样性分析结果,AD组、CON组不同时间点肠型分布在相同区域,不同组别肠型分布在不同区间。2组动物的肠道菌群在微生物物种构成方面存在显著性差异(P<0.05)。AD组小鼠在建模10周时血液和脑中Aβ40含量升高(P<0.05,P<0.01),与CON组比较差异有显著性。与老年斑形成相关的细胞因子检测,IL-1β在建模6周时浓度降低(P<0.05);IL-10在建模6周时升高(P<0.01);TGF-β在建模10周时浓度降低(P<0.01),与CON组比较差异有统计学意义。组织病理学检查未见老年斑生成。结论本研究通过接种患者粪便悬液的方法建立了阿尔茨海默症人源菌群小鼠模型,模型小鼠肠道菌群的结构丰度、与老年斑生成相关细胞因子含量等指标的改变与阿尔茨海默症病人的临床表现类似。

冠心病人源肠道菌群小鼠模型的建立及评价

目的通过粪菌移植方法建立冠心病人源肠道菌群(human flora-associated,HFA)小鼠模型并对模型进行评价。方法28只无菌雌性C57BL/6J小鼠分为对照(CON)组和模型(CAD)组,分别接种健康志愿者和冠心病患者新鲜粪便悬液,移植后6周和10周每组安乐7只动物,取粪便、血液、主动脉进行16S rDNA、血脂、细胞因子和组织病理学检查。结果从第5周开始CAD组动物体重增长加快(P<0.05)。α-多样性分析,CAD组的Simpson指数在两个时间点的数值均升高(P<0.05,P<0.01),Shannon指数(P<0.05,P<0.01)、ACE(P<0.05)和Chao1指数均降低(P<0.05)。CON组reads主要分布在厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)。造模6周时,CAD组厚壁菌门、软壁菌门丰度降低(P<0.05),拟杆菌门、疣微菌门丰度升高(P<0.01);造模10周时,CAD组厚壁菌门丰度降低(P<0.01),拟杆菌门、疣微菌门丰度升高(P<0.01)。β-多样性分析,CAD组、CON组的肠型分布在不同区域,同一组的不同阶段则分布在相同区域。CAD组与CON组在微生物物种构成方面存在显著性差异(P<0.05)。CAD组小鼠在建模6周和10周时血液中甘油三酯(TG)(P<0.05,P<0.01),胆固醇(TC)(P<0.05),乳酸脱氢酶(LDH)(P<0.01,P<0.0001)和磷酸激酶(CK)(P<0.01,P<0.05)值均升高。低密度脂蛋白(LDL-C)在建模6周时升高(P<0.05)。细胞因子检测,IL-6在建模6周时浓度升高(P<0.05),10周时减低(P<0.00001);IL-10在建模10周时浓度降低(P<0.05);IL-2、IL-4、IL-5、IL-1β在建模10周时浓度升高(P<0.0001,P<0.05,P<0.0001,P<0.01)。IL-12p70、TNF-α、INF-γ在两个时间点差异无统计学意义。CAD组及CON组小鼠的冠状动脉苏木素-伊红(H.E)染色在建模后两个时间点均未见泡沫细胞形成等动脉粥样硬化改变。结论本研究利用粪菌移植方法获得冠心病人源菌群小鼠,肠道菌群结构丰度、体重、血脂、细胞因子含量等指标出现了与临床类似的改变。

链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型肠道菌群变化

目的观察链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导糖尿病大鼠模型肠道菌群结构和丰度的变化。方法雄性SD大鼠25只,随机分为对照组(C)10只、模型组(M)15只。模型组腹腔注射3%的STZ,剂量30 mg/(kg·bw),连续5 d。成模后每月测量体重、血糖等指标。模型成立4周和12周时,分别在同一时间取各组大鼠的新鲜直肠粪便。在Illumina高通量测序平台上对粪便样本中细菌16S r DNA-V3区进行测序,对肠道菌群结构、丰度进行定量分析。结果模型组和对照组获得的优化序列数差异无显著性(P>0.05)。模型组动物肠道菌群的相对丰度指数(Chao1)、多样性指数Shannon与对照组比较降低(P<0.05),Simpson指数与对照组比较升高(P<0.05)。在门水平,变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)、TM7、放线菌门(Actinobacter)相对丰度降低(P<0.05)。在属水平,造模4周,模型组乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度降低(P<0.05);拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度升高(P<0.05)。造模12周,模型组乳杆菌属(Lactobacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)相对丰度升高(P<0.05);双歧杆菌属(Bifidobacterium)相对丰度降低(P<0.05)。结论 STZ诱导的SD大鼠糖尿病动物肠道菌群的丰度和多样性降低,为糖尿病与肠道菌群关系研究提供参考。

基于高通量测序的不同年龄恒河猴肠道菌群结构差异分析

目的观察不同年龄恒河猴肠道菌群结构和丰度的变化。方法 50只恒河猴,分为成年(5～10岁)、老年(10岁以上)2组,其中成年组33只,老年组17只。采集动物的新鲜直肠粪便,提取DNA后使用Illumina高通量测序平台对样本中细菌16S rDNA-V3区进行测序,定量分析肠道菌群的结构和丰度。结果老年组和成年组获得的优化序列数差异无显著性(P> 0.05)。α-多样性分析,老年组恒河猴肠道菌群的Chao1指数(P=0.0174)、Simpson指数(P=0.0258)、ACE指数(P=0.0121)与成年组比较降低,Shannon指数与成年组比较升高(P=0.0132)。老年组与成年组相比,在门水平,拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度升高(P=0.0013),厚壁菌门(Firmicutes)、螺旋体门(Spirochaetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、粘胶球形菌门(Lentisphaerae)相对丰度降低(P=0.0283,P=0.0002,P=0.0482,P=0.0242)。在科水平,Prevotellaceae相对丰度升高(P=0.0001),Ruminococcaceae、Clostridiales、Spirochaetaceae、Christensenellaceae相对丰度降低(P=0.0039,P=0.0080,P=0.0002,P=0.0021)。在属水平,老年组unidentified_Prevotellaceae相对丰度升高(P=0.0001),乳杆菌属(Lactobacillus)、八迭球菌(Sarcina)、unidentified_Spirochaetaceae相对丰度降低(P=0.0114,P=0.0227,P=0.0028)。β-多样性分析,老年组肠道菌群与成年组分布在不同区域,差异有显著性(P=0.003)。LEfSe分析,在成年组,链球菌属(Streptococcus)、布赫纳氏菌属(buchnera)、乳杆菌属(lactobacillus)是具有统计学意义的生物标记物。结论恒河猴肠道菌群的结构随年龄增长而改变。丰度降低,多样性增高。

基于LC-MS的冠心病人源菌群小鼠代谢组学研究

目的使用基于液态色谱-质谱联用法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)的非靶向代谢组学技术研究冠心病人源菌群小鼠特征性代谢产物。方法 28只无菌雌性C57BL/6J小鼠分为对照组(CON)和模型组(CAD),分别接种健康志愿者和冠心病患者的新鲜粪便悬液,移植后6周和10周每组安乐7只动物采集血浆,使用LC-MS技术对小鼠的血浆代谢物进行研究,运用PCA和PLS-DA统计学方法鉴别特征代谢物及相关代谢通路。结果最终通过标准品确认30个在2个时间点均存在的特征性差异代谢物。其中L-肉毒碱、苯丙酮酸、1-萘酚、2-萘酚在模型组显著升高。胆汁酸代谢通路、甘氨酸丝氨酸和苏氨酸代谢途径在建模6周、10周均下调。结论冠心病人源菌群小鼠出现与患者类似的代谢紊乱。

无菌APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠模型建立及脑内斑块变化初步观察

目的 使用剖宫产净化方法建立无菌APPswe/PS1ΔE9(PAP)双转基因小鼠模型并对动物脑内斑块沉积情况进行初步观察,为研究肠道菌群与阿尔茨海默症关系提供新的动物模型。方法 选择阳性PAP雄性杂合子鼠与经产的C57野生型雌鼠1∶2进行交配。怀孕母鼠在超净工作台内行剖宫产手术,用无菌ICR小鼠代乳。术后每个月进行无菌状态检测;PCR方法检测剖宫产所得PAP仔鼠的基因型;免疫组化方法定量检测9月龄PAP小鼠脑内斑块变化情况。结果 实施剖宫产手术12例,获仔鼠66只,剖宫产存活率及离乳存活率分别为95.45%(63/66)和95.24%(60/63),净化后按国标检测无菌状态均为合格。免疫组化结果显示9月龄无菌PAP小鼠海马内斑块较同月龄SPF级动物减少。结论 通过剖宫产净化技术去除了PAP小鼠携带的菌群,9月龄无菌PAP小鼠脑内斑块减少。

基于医学生科研创新能力培养的第二课堂实践研究

如何通过课程学习培养医学生的科研思维能力是每一位医学教育工作者应该思考的问题。文章通过开设程序化的医学细胞生物学第二课堂科研活动,探索适合医学生科研创新能力培养的教学方法,为高校教师开展基于科研创新能力培养的第二课堂建设与实践提供参考。

猪圆环病毒3型Cap基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为了建立快速检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的间接ELISA检测方法,试验根据分离的辽宁株PCV3(LN-PCV3)CaP蛋白信号肽预测结果及B细胞抗原表位预测结果选定靶序列,连接到表达载体pET-32a中,并将其转化至BL21宿主菌,经IPTG诱导后表达并纯化。在此基础上,以纯化后Cap重组蛋白为包被抗原,建立检测PCV3间接ELISA抗体检测方法,确定检测方法的阴阳性临界值、交叉反应、重复性及敏感性,并用建立的PCV3间接ELISA抗体检测方法对临床样品进行检测。结果表明:以LN-PCV3株Cap基因B细胞抗原表位集中区域为靶序列构建表达质粒,成功实现了PCV3 Cap基因在BL21宿主菌中的高效表达,并建立了PCV3间接ELISA抗体检测方法。该检测方法阴阳临界值为0.262,与常见猪病毒阳性血清无交叉反应,阳性血清稀释至1∶3 200检测仍为阳性;批内、批间重复试验的变异指数均小于10%;与传统RT-PCR方法总符合率为90.9%。说明该检测方法具有良好的特异性、敏感性以及重复性,为进一步开发商品化PCV3抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础。

蜜蜂残翼病毒VP2基因密码子优化、原核表达及免疫原性分析

蜜蜂残翼病毒(Deformed wing virus,DWV)是引发世界各地大范围蜂群损失的主要嫌疑对象,间接给农业生产带来了巨大的经济损失。为了探究DWV结构蛋白VP2的免疫原性,深入研究该蛋白的功能和为制备DWV单克隆抗体提供可靠的免疫原,本研究从DWV分离株(GenBank登录号:MF770715)扩增得到VP2基因,同时根据大肠杆菌密码子的偏嗜性对VP2基因进行优化并合成,分别将优化前和优化后的VP2基因克隆到pET-28a载体上,获得重组质粒pET-28a-VP2和pET-28a-opti-VP2,分别转化至宿主菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测,显示仅优化后的opti-VP2基因高效表达,然后对最佳表达条件进行摸索。在此基础上,对重组蛋白纯化后分3次免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,同时设置纯化病毒组和空白对照组,对免疫小鼠的抗体水平和淋巴细胞增殖指数(SI)以及干扰素(IFN-γ)、白介素IL-2和IL-4水平进行检测。结果表明,重组VP2蛋白能够诱导产生特异性抗体,促进淋巴细胞增殖,提高IFN-γ、IL-2和IL-4水平,具有良好的免疫原性,为深入研究DWV VP2蛋白功能和开发防治DWV的生物制剂提供了帮助。

RNAi靶向VP2基因抑制中蜂囊状幼虫病毒在中华蜜蜂幼虫体内复制研究

中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)是造成中华蜜蜂患病死亡的主要原因之一,目前尚无有效的治疗方法。为了研究靶向中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2基因的siRNA介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用和其对CSBV在中华蜜蜂幼虫体内复制的影响,设计合成针对CSBV VP2基因的特异性siRNA,以100 nM的浓度与pEGFPN1-VP2-CSBV融合表达载体共同转染至293T细胞中,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析siRNA在体外对CSBV VP2基因表达的干扰效果。同时,将siRNA(1μg/μL)和1×10~7拷贝数的CSBV共同饲喂2日龄中华蜜蜂幼虫,检测幼虫体内CSBV拷贝数和幼虫存活率,研究siR-NA对中华蜜蜂幼虫体内CSBV复制的影响。荧光结果显示,在293T细胞中siRNA能抑制CSBV VP2蛋白的表达,并且通过流式细胞仪检测分析发现干扰效果接近40%。幼虫饲喂实验表明,饲喂siRNA组在各时间点幼虫体内CSBV拷贝数均低于CSBV对照组,且在摄入siRNA后感染CSBV的幼虫存活率明显上升,与CSBV组差异极显著(P<0.01)。通过本研究,证明了针对CSBV结构蛋白VP2基因的特异性siRNA能够介导产生RNAi,影响CSBV在中蜂体内的复制,为深入研究CSBV VP2基因的功能和研发抗CSBV生物制剂提供了理论基础。